黃 慧傅應(yīng)云齊 暉

（1 深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，廣東 深圳 518000；2 深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518000）

IL-6、IL-18和TPO等指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)膿毒癥預(yù)后的意義

黃 慧1傅應(yīng)云1齊 暉2

（1 深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，廣東 深圳 518000；2 深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518000）

目的 膿毒癥是指感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，可發(fā)展為膿毒性休克和多器官功能衰竭。通過測(cè)定和比較膿毒癥存活和死亡患者血清中炎性細(xì)胞因子的濃度，探討簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的無創(chuàng)傷性指標(biāo)，準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)病情發(fā)展。方法 分別通過流式細(xì)胞儀測(cè)定法和ELISA法測(cè)定膿毒癥患者血中FITC-CD14陽性細(xì)胞比率、IL-6、IL-18、PLT和TPO等指標(biāo)，記錄患者的預(yù)后。結(jié)果 膿毒癥死亡組的FITC-CD14陽性細(xì)胞（%）顯著高于存活組（44.19±2.59 vs 33.71±8.54，P＜0.01），存活組也顯著高于正常對(duì)照組（33.71±8.54 vs 16.27±2.25，P＜0.01）。死亡組的IL-6明顯高于對(duì)照組（25.65±3.34 vs 17.3±4.05，P＜0.01），存活組高于對(duì)照組（24.78±6.01 vs 17.3±4.05，P＜0.01），但死亡組與存活組之間無顯著差異（P=0.68）。膿毒癥患者IL-18濃度顯著高于正常對(duì)照組，并且死亡組與存活組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膿毒癥患者PLT低于對(duì)照組，TPO顯著高于對(duì)照組，死亡組與存活組之間的PLT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TPO則存在顯著差異。結(jié)論 膿毒癥是全身炎性反應(yīng)綜合征的晚期失代償表現(xiàn)，常導(dǎo)致膿毒性休克和多器官功能衰竭，病死率很高。測(cè)定膿毒癥患者血中FITC-CD14陽性細(xì)胞、IL-18和TPO等指標(biāo)可以早期、準(zhǔn)確地進(jìn)行預(yù)后判斷，有助于建立正確的治療目標(biāo)。

FITC-CD14細(xì)胞；IL-6；IL-18；TPO；膿毒癥；預(yù)后

膿毒癥是指感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，積極探討與膿毒癥預(yù)后有關(guān)的因素，將有利于防止膿毒癥患者病情進(jìn)一步惡化和改善患者預(yù)后[1]。本研究主要通過測(cè)定和比較膿毒癥存活和死亡患者血清中炎性細(xì)胞因子的濃度，探討簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的無創(chuàng)傷性指標(biāo)，客觀地判斷患者病情的嚴(yán)重程度，準(zhǔn)確地對(duì)病情發(fā)展進(jìn)行預(yù)測(cè)，為醫(yī)生制定正確的治療方案，改善醫(yī)患溝通，減輕患者痛苦提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例的選擇

入選標(biāo)準(zhǔn)：參照2003年美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)和危重病醫(yī)學(xué)會(huì)制定的膿毒癥診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]：有原發(fā)感染病灶或菌血癥，同時(shí)具備下列4項(xiàng)中的2項(xiàng)：①體溫＞39℃或＜36℃；②心率＞120次/分；③呼吸頻率＞28次/分或二氧化碳分壓＜32mmHg；④白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞12×109/L或＜4.0×109/L，其中中性粒細(xì)胞＞0.80，未成熟粒細(xì)胞＞0.10。排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)存在自身免疫性疾病、腫瘤或正在使用免疫抑制劑者。對(duì)入選病例進(jìn)行急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分（APACHEII評(píng)分）。抽取靜脈血15mL。其中5mL用于FITC-CD14陽性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定，10mL用于白細(xì)胞介素6 （IL-6）、白細(xì)胞介素18 （IL-18）和血小板生成素（TPO）的測(cè)定。記錄患者在30d內(nèi)是否死亡。對(duì)照組為同期在我院進(jìn)行健康檢查的正常成年人。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備

FITC-CD14熒光標(biāo)記抗體為Biolegend公司生產(chǎn)，溶血?jiǎng)┯蒊mmunoprobe公司提供，牛血清白蛋白由Amresco公司提供，IL-6、IL-18和TPO的ELISA試劑盒分別由深圳晶美公司、Bender公司和R&D公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為Coulter公司生產(chǎn)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 FITC-CD14陽性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定

①分離細(xì)胞：取抗凝全血150 μL，用溶血?jiǎng)? mL溶血，充分混勻，室溫下避光10 min后以1100 r/min離心5 min，棄去上清。加2 mL PBS洗滌沉淀細(xì)胞后以1100 r/min離心5 min。棄去上清，加入200 μL PBS懸浮沉淀細(xì)胞。將上述細(xì)胞懸液20 μL用PBS稀釋10倍后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度。②熒光標(biāo)記：將流式細(xì)胞測(cè)試管分為對(duì)照管和樣品管，分別加入1.2×105個(gè)細(xì)胞，再加入牛血清白蛋白，37.5℃孵育30min，加入PBS沖洗未結(jié)合的蛋白，以1100 r/min離心5 min。棄去上清，加入熒光標(biāo)記抗體，對(duì)照管內(nèi)加入等量PBS。在室溫下孵育20 min。然后兩管均加入2 mL PBS 1100 r/min離心5 min。棄上清，再次加入牛血清白蛋白結(jié)合，再用PBS沖洗，棄上清后，加1%多聚甲醛200 μL固定細(xì)胞。③流式細(xì)胞儀測(cè)定：用白細(xì)胞設(shè)門，共分析25000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定FITC-CD4陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 IL-6、IL-18和TOP的測(cè)定

將10mL靜脈血在室溫下放置30min，然后低溫3000 r/min離心10 min，分離血清，貯存于-80℃冰箱。用相應(yīng)的ELISA試劑盒按照說明書的具體步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 病例資料

收集我院2009年3月至2012年12月外科ICU和呼吸ICU的膿毒癥病例共87例，其中17例因存在排除標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的情況而排除在研究病例之外。共70例膿毒癥患者進(jìn)入研究范圍，其中男39例，女31例，年齡22～74歲，平均（50.6±8.9歲）。對(duì)照組為20例，其中男14例，女6例，年齡21～65歲，平均（45.9±9.7歲）。

2.2 膿毒癥組和對(duì)照組的血清FITC-CD14陽性細(xì)胞數(shù)、IL-6、IL-18、PLT和TPO水平，見表1。

3 討 論

膿毒癥是多種疾病在發(fā)生發(fā)展過程中表現(xiàn)出來的一種病理生理過程，主要由感染性因素引起，如革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、病毒等病原體入侵所致。這些感染因素迅速激活機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)釋放大量促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步誘發(fā)失控性炎性反應(yīng)，即全身炎性反應(yīng)綜合征[3]。

CD14作為內(nèi)毒素誘發(fā)疾病過程中的重要受體，是體內(nèi)增敏內(nèi)毒素細(xì)胞效應(yīng)的主要系統(tǒng)之一[4]，屬細(xì)胞表面糖蛋白家族成員之一。國(guó)外研究表明CD14是重要的脂多糖受體，識(shí)別、結(jié)合LPS或LPS/LBP復(fù)合物，介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng)，使內(nèi)毒素的生物活性提高數(shù)百倍甚至數(shù)千倍，在炎性反應(yīng)、膿毒癥等病理反應(yīng)中起重要作用[5]。方文慧等發(fā)現(xiàn)組織CD14表達(dá)上調(diào)可能增強(qiáng)內(nèi)毒素刺激局部組織合成、產(chǎn)生TNF-α效應(yīng)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥死亡組的FITC-CD14陽性細(xì)胞（%）顯著高于存活組（44.19±2.59 vs 33.71±8.54，P＜0.01），存活組也顯著高于正常對(duì)照組（33.71±8.54 vs 16.27±2.25，P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。該結(jié)果提示如果能夠完全封閉CD14的功能，就可以防止LPS介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，對(duì)臨床治療內(nèi)毒素血癥將有重要意義。

表1 三組患者血清FITC-CD14陽性細(xì)胞數(shù)、IL-6、IL-18、PLT和TPO水平

IL-6能誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞分化，刺激肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白，催化和放大炎性反應(yīng)和毒性作用，造成組織細(xì)胞的損害，反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度[7]。本研究發(fā)現(xiàn)死亡組的IL-6明顯高于對(duì)照組（25.65±3.34 vs 17.3±4.05，P＜0.01），存活組高于對(duì)照組（24.78 ±6.01 vs 17.3±4.05，P＜0.01），但死亡組與存活組之間無顯著差異（P=0.68），可能提示IL-6的濃度與膿毒癥患者的預(yù)后無關(guān)。這與國(guó)外報(bào)道的結(jié)果[8]不一致，可能與研究對(duì)象的數(shù)量和測(cè)定方法不同有關(guān)。IL-18是近年發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥介質(zhì)，能促進(jìn)致炎因子的釋放，上調(diào)細(xì)胞間粘附分子（ICAM）的表達(dá)。其主要生物學(xué)作用是促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[9]，促進(jìn)T細(xì)胞增強(qiáng)，加強(qiáng)Fas1介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)[10]。本研究測(cè)定結(jié)果提示膿毒癥患者IL-18濃度顯著高于正常對(duì)照組，并且死亡組與存活組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-18表達(dá)的升高可帶來負(fù)面影響，可能不僅加重疾病和引起組織損害，甚至可能預(yù)示死亡。不同預(yù)后的膿毒癥患者具有不同的IL-18濃度，而IL-6濃度則沒有這種顯著差異，意味著IL-18比IL-6更能準(zhǔn)確地反映膿毒癥的預(yù)后。

SIRS和膿毒癥是嚴(yán)重感染的并發(fā)癥。膿毒癥時(shí)循環(huán)血內(nèi)各種毒素和炎性細(xì)胞因子循環(huán)于全身各個(gè)組織器官，其中以骨髓對(duì)毒素和炎癥介質(zhì)反應(yīng)最早，也是最敏感的器官之一，具體表現(xiàn)為例如白細(xì)胞增高、血小板減少，嚴(yán)重時(shí)全血細(xì)胞下降。骨髓穿刺因有創(chuàng)傷性，并且病情危重時(shí)骨髓檢查操作受限，所以骨穿作為臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)具有局限性，而采血測(cè)定則簡(jiǎn)單方便，所以可作為危重病患者的可靠監(jiān)測(cè)指標(biāo)。膿毒癥患者普遍存在凝血功能紊亂[11]。目前認(rèn)為血小板減少是ICU患者獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)之一[12]。本研究死亡組與存活組之間的的血小板計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示雖然血小板減少可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素預(yù)測(cè)危重病患者預(yù)后，但血小板的動(dòng)態(tài)變化可能具有更準(zhǔn)確的預(yù)警價(jià)值。

TPO是介導(dǎo)血小板產(chǎn)生的最主要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子[13]。其含量主要受血小板與巨核細(xì)胞數(shù)及血小板與巨核細(xì)胞膜表面TPO受體總量的負(fù)調(diào)控。在本研究中，血小板減少的患者的TPO水平升高，可能與血小板生成減少有關(guān)，因此感染、藥物因素引起的血小板減少癥患者TPO水平變化較大。同時(shí)監(jiān)測(cè)膿毒癥患者的血小板計(jì)數(shù)和血清TPO水平有助于區(qū)分血小板減少的原因是生成減少或破壞增加[14]。

綜上所述，膿毒癥是全身炎性反應(yīng)綜合征的晚期失代償表現(xiàn)，常導(dǎo)致膿毒性休克和多器官功能衰竭，病死率很高。測(cè)定膿毒癥患者血中FITC-CD14陽性細(xì)胞、IL-18和TPO等指標(biāo)可以早期、準(zhǔn)確地進(jìn)行預(yù)后判斷，有助于建立正確的治療目標(biāo)。

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