黃李淑馨，劉 鋼，岳 敏，曹海龍，譚海東，趙小明，尹 恒，* ，杜昱光，*

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116023;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049;3.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023)

褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(mannuronate，M)和α-L-古洛糖醛酸(guluronate，G)組成的直鏈多糖。兩種糖醛酸單體通過α/β-1，4 糖苷鍵隨機(jī)排列成褐藻膠分子中的聚甘露糖醛酸片段(polyMblock)，聚古洛糖醛酸片段(polyG-block)以及MG 交替嵌段(polyMG-block)［1］。褐藻膠結(jié)構(gòu)復(fù)雜，物化性質(zhì)多樣，因而它被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域［2］。此外，褐藻膠寡糖因具有免疫調(diào)節(jié)［3］和神經(jīng)保護(hù)［4］等生物活性，所以它可被開發(fā)成獨(dú)特療效藥物或功能性食品。近年來，隨著對(duì)褐藻膠及其寡糖的功能評(píng)價(jià)和開發(fā)研究的不斷深入，“量身定制”(tailor-made)的新理念被提出，即指設(shè)計(jì)具有確定結(jié)構(gòu)和聚合度的褐藻膠及其寡糖，使其物化性質(zhì)或生物活性滿足特定用途的需要［5］。褐藻膠裂解酶是一類通過β-消去反應(yīng)斷裂褐藻膠的裂解酶，因其具有專一、高效及反應(yīng)溫和等優(yōu)點(diǎn)，被視為改造褐藻膠的有力工具。褐藻膠裂解酶按底物專一性可分為聚甘露糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.3)和聚古洛糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)，也可按反應(yīng)模式分為內(nèi)切或外切酶［6］。褐藻膠裂解酶還可用于降解菌膜［7］及生產(chǎn)生物燃料［8］。受底物專一性和反應(yīng)模式的影響，單一類型的酶能斷裂的褐藻膠位點(diǎn)有限。因此，篩選褐藻膠代謝新菌株，尋找不同類型的酶對(duì)開發(fā)高值化褐藻膠及其寡糖產(chǎn)品具有重要意義。本研究從海南采集的多類樣品中篩到高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的4株菌，然后研究了其產(chǎn)酶規(guī)律，并通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在獲得新酶源微生物資源，為酶的克隆表達(dá)及酶法改造褐藻膠奠定基礎(chǔ)。

表1 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的來源Table 1 Sources of 10 alginate lyase-producing strains

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供分離的37 個(gè)樣品(包括土壤、淤泥、淡水和海水) 分別采自海南省的風(fēng)爐嶺、紅樹林、玉帶灘、七仙嶺、五指山、天涯海角、黎安鎮(zhèn)漁港及?？谑兄苓吽a(chǎn)海藻工廠等地區(qū);無機(jī)營養(yǎng)鹽溶液(1000mL):NaCl 5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g;分離培養(yǎng)基(1000mL):無機(jī)營養(yǎng)鹽溶液中加入褐藻酸鈉7g，(NH4)2SO45g，瓊脂20g，pH7.2;產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL):無機(jī)營養(yǎng)鹽溶液中加入褐藻酸鈉10g，蛋白胨5g，酵母粉1g，pH7.2;種子培養(yǎng)基同發(fā)酵培養(yǎng)基;褐藻酸鈉 美國Sigma 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒及PCR 反應(yīng)所用的相關(guān)試劑 均購自寶生物工程(大連)有限公司;凝膠回收試劑盒 北京博邁德科技發(fā)展有限公司。

LRH 系列生活培養(yǎng)箱、HWS24 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;Veriti 型PCR 儀 美國ABI 公司;GelDoc-It 型凝膠成像儀 美國UVP 公司;Thermo Multiskan Ascent 酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems 公司;IX73型顯微鏡 日本Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 稱取土壤或淤泥10g，放入盛有90mL 無菌水及玻璃珠的三角瓶中，220r/min 振蕩15min 使樣品充分分散，梯度稀釋后涂布于含有褐藻酸鈉的分離培養(yǎng)基平板。30℃倒置培養(yǎng)2～3d，挑取生長(zhǎng)良好、形態(tài)不一的菌落進(jìn)行多次劃線純化，并結(jié)合顯微鏡觀察得到純菌株。海水和淡水樣品直接進(jìn)行梯度稀釋后涂布分離培養(yǎng)基平板。

1.2.2 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的初篩 將分離得到的菌株挑取一環(huán)，接種于50mL 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min 條件下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基粘度變化。培養(yǎng)4d 后取發(fā)酵上清液檢測(cè)是否有酶活。

1.2.3 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的產(chǎn)酶菌株挑取一環(huán)，接種于25mL 種子培養(yǎng)基，30℃、150r/min 搖床培養(yǎng)24h。種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接于50mL 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min 培養(yǎng)。分別于1 ～6d 取樣，將發(fā)酵液12000r/min 離心10min，取上清液作為粗酶液測(cè)酶活。

1.2.4 褐藻膠裂解酶活力的測(cè)定 酶活力測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)［9］，以0.5%(w/v)褐藻酸鈉為底物，測(cè)定發(fā)酵上清液中的褐藻膠裂解酶活力。酶活力單位定義為:每分鐘釋放1μmol 還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。發(fā)酵液酶活力單位定義為每毫升發(fā)酵液含酶活單位(U/mL)。

1.2.5 16S rDNA 序列測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將目的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、150r/min 搖床培養(yǎng)20h，12000r/min 離心10min 收集菌體，按試劑盒操作步驟提取菌株的基因組DNA。采用通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCM［C:A］TGGCTCAG-3')和1518r(5'-AAGGAGGTGATCCAN［A:C:G:T］CCR［A:G］CA-3')［10］，以菌株基因組DNA 為模板進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為:95℃5min;94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30 個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

將16S rDNA 測(cè)序結(jié)果在NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 檢索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，選取同源性較高菌株的16S rDNA 序列，采用MEGA5.1軟件選擇模型，然后用BEAST v1.7.5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［11-12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選

采用褐藻酸鈉為唯一碳源的分離平板從海南樣品中分離出菌株，然后將菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初篩。初篩基于的原理是褐藻酸鈉溶于水能形成粘稠狀溶液，若菌株在含有褐藻酸鈉的粘稠培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并使其粘度下降，說明菌株可以分解褐藻酸鈉［13］;同時(shí)若該菌株的培養(yǎng)基上清液用DNS 法檢測(cè)到酶活，則進(jìn)一步確認(rèn)該菌株產(chǎn)褐藻膠裂解酶。采用雙重指標(biāo)進(jìn)行初篩，能有效避免假陽性結(jié)果，該篩選模型的建立為今后的實(shí)驗(yàn)者提供了良好的參考依據(jù)。

通過初篩，獲得了具有產(chǎn)褐藻膠裂解酶能力的10 個(gè)菌株，它們的來源見表1。從表1 可以看出，產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌群分布范圍較寬，它們不僅存在于海水、腐爛海藻中，還存在于火山砂土、淡水河流泥沙中。

將初篩得到的10 株菌經(jīng)種子培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于第24、48、72、96、120、144h 檢測(cè)發(fā)酵上清液中酶活。通過復(fù)篩，獲得4 株具有較好產(chǎn)酶能力的菌株，編號(hào)分別為W14、S20、E03 和W13，它們的發(fā)酵液酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖1 所示。由圖1 可以看出，4 株菌中菌株E03 的發(fā)酵液酶活最高(0.58U/mL)，并且在培養(yǎng)48～72h 內(nèi)其酶活呈現(xiàn)陡增態(tài)勢(shì)，72h 后發(fā)酵液中酶活逐步下降。菌株S20 和W14 的最高發(fā)酵液酶活相當(dāng)(0.23～0.27U/mL)，但其產(chǎn)酶高峰期不同。菌株S20 在培養(yǎng)前期(24～48h)迅速達(dá)到產(chǎn)酶高峰，而此階段W14 的發(fā)酵液檢測(cè)不到酶活，直至培養(yǎng)中期(48～96h)W14 產(chǎn)酶顯著增加至高峰。菌株W13 的發(fā)酵液酶活稍低(0.13U/mL)，但其在培養(yǎng)72h 內(nèi)產(chǎn)酶平穩(wěn)。

圖1 褐藻膠裂解酶活性變化曲線Fig.1 Activition curve of alginate lyases

2.2 菌落及菌株形態(tài)觀察

菌株E03 單個(gè)菌落呈淡粉色半透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，菌苔粘稠，容易形成融合狀態(tài)菌落(圖2A)，革蘭氏染色陰性，菌體呈球桿狀，可見單個(gè)散生或形成兩個(gè)聚集(圖2E)。菌株S20 單個(gè)菌落呈橙黃色不透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊(圖2B)，革蘭氏染色陰性，菌體為桿狀，可見單個(gè)散生(圖2F)。菌株W13 單個(gè)菌落呈白色半透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊(圖2C)，革蘭氏染色陰性，菌體為桿狀，兩端鈍園，可見單個(gè)散生或形成多個(gè)聚集(圖2G)。菌株W14 單個(gè)菌落呈白色不透明，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，菌苔粘稠，容易形成融合狀態(tài)菌落(圖2D)，革蘭氏染色陰性，菌體為桿狀，可見單個(gè)散生或形成2～3 個(gè)聚集(圖2H)。

圖2 菌株E03、S20、W13 和W14 的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)(×1000)Fig.2 The colonial morphology and micrograph of four bacteria strains

2.3 16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株E03、S20、W13 和W14 的16S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為1460bp 左右(圖3)，經(jīng)測(cè)序后提交至 GenBank (登錄號(hào):KC777292、JQ886462、KC777293 和KC777294)。將4 個(gè)菌株的16S rDNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)，然后分別選取同源性較高菌株的16S rDNA 序列，采用BEAST 軟件構(gòu)建了4 個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從圖4 上可以看出，發(fā)育樹分為兩大聚類分支，它們分別從屬于擬 桿 菌 門 (Bacteroidetes ) 和 變 形 菌 門(Proteobacteria)。黃桿菌屬(Flavobacterium)屬于擬桿菌門，假單胞菌屬(Pseudomonas)和弧菌屬(Vibrio)均屬于變形菌門。據(jù)推測(cè)，約25 億年前變形菌門與其它門從共同祖先發(fā)生分歧［14］，因此，在圖4 的發(fā)育樹上，假單胞菌屬和弧菌屬聚類的大分支在進(jìn)化的較早時(shí)期就與黃桿菌屬分開。假單胞菌屬和弧菌分屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)中不同的目，因此，在圖4 的發(fā)育樹上，假單胞菌屬分支和弧菌屬分支于進(jìn)化的較晚時(shí)期才分開。此外，圖4 還顯示了菌株S20 與黃桿菌屬菌株聚類于同一分支，而菌株E03 落在假單胞菌屬菌株聚類分支中，菌株W13和W14 則落在弧菌屬菌株聚類分支中。雖然菌株W13 和W14 在此系統(tǒng)發(fā)育樹上聚于同一小分支，但它們的產(chǎn)酶規(guī)律和菌落形態(tài)有明顯差異，提示它們可能屬于弧菌屬內(nèi)不同的種。由菌落形態(tài)特征結(jié)合16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定菌株S20 屬于黃桿菌屬(命名為Flavobacterium sp.S20)，菌株E03 屬于假單胞菌屬(命名為Pseudomonas sp.E03)，菌株W13 和W14 屬于弧菌屬(分別命名為Vibrio sp.W13，Vibrio sp.W14)。

圖3 菌株E03、S20、W13 和W14 的16S rDNA 電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern of the PCR products of 16S rDNA of strains

微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源，目前，在海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌、真菌中均發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌種，其中假單胞菌屬、弧菌屬的產(chǎn)酶菌株報(bào)道較多［6］，而黃桿菌屬產(chǎn)酶菌株報(bào)道較少［9］。假單胞菌是典型的聚甘露糖醛酸片段裂解酶生產(chǎn)源，某些假單胞菌菌株還產(chǎn)其他類型的褐藻膠裂解酶，如Pseudomonas aeruginosa PAO1 產(chǎn)偏好降解MG 交替嵌段的裂解酶［15］。海洋弧菌也是很好的獲取聚甘露糖醛酸片段裂解酶和聚古洛糖醛酸片段裂解酶的菌源［16-17］。黃桿菌菌株S20 產(chǎn)聚古洛糖醛酸片段裂解酶，并且研究發(fā)現(xiàn)該菌株還產(chǎn)其他類型的褐藻膠裂解酶［18］。本研究獲得的假單胞菌新菌株E03、弧菌新菌株W13 和W14、黃桿菌新菌株S20 可作為獲得不同類型褐藻膠裂解酶的菌種資源，為下一步酶的克隆表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)研究以及酶法開發(fā)高價(jià)值化褐藻膠及其寡糖產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

圖4 菌株E03、S20、W13 和W14 的16S rDNA 的序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of four bacteria strains

3 結(jié)論

本研究采用褐藻酸鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基，對(duì)采自海南的多類樣品進(jìn)行菌株分離，然后選用觀察培養(yǎng)基粘度變化和酶活力檢測(cè)的雙重指標(biāo)對(duì)菌株初篩，獲得具有產(chǎn)褐藻膠裂解酶能力的10 個(gè)菌株。通過測(cè)定發(fā)酵液酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，最終獲得高產(chǎn)褐藻膠裂解酶且產(chǎn)酶規(guī)律顯著差異的4 株菌。通過形態(tài)學(xué)結(jié)合16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育同源分析，初步鑒定菌株E03 屬于假單胞菌屬，菌株W13 和W14 屬于弧菌屬，而菌株S20 屬于產(chǎn)褐藻膠裂解酶報(bào)道較少的黃桿菌屬。

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