杜 飛(綜述)，畢燕龍(審校)

同濟大學附屬同濟醫(yī)院眼科，上海 200065

CEC 位于角膜最內(nèi)層，是人體上唯一可被窺視的活體內(nèi)皮細胞，其特定的單層六角形細胞鑲嵌結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)主動液泵功能可維持角膜的透明及角膜厚度的相對恒定。當其受外傷、疾病或手術(shù)等損傷后，缺失的細胞區(qū)域由周圍細胞增大、擴展和移行來填補，而細胞移行可導(dǎo)致平均細胞密度(cell density，CD)降低和細胞形態(tài)改變［1］。本文對CEC的檢測及分析做一綜述。

1 CEC 檢測方法

1.1 顯微鏡

顯微鏡以顯微原理分為光學顯微鏡與電子顯微鏡。目前光學顯微鏡可把物體放大1500 倍，分辨的最小極限達0.2 μm。電子顯微鏡可把物體放大到200 萬倍。結(jié)合各種電鏡樣品制備技術(shù)，可對細胞進行多方面結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入研究。

1.1.1 光學顯微鏡

裂隙燈顯微鏡 彌散照明法可對角膜行全面觀察。直接焦點照明法可對細節(jié)如角膜后沉積物(KP)行精細觀察。用鏡面反光照射法時可觀察角膜前后細微變化如角膜內(nèi)皮的紋理變化。后部反光照射法便于發(fā)現(xiàn)CEC 水腫。新一代產(chǎn)品可對角膜上皮、基質(zhì)神經(jīng)走形、角膜緣血管網(wǎng)及CEC 細節(jié)行更為精確的觀察，同時配備高清數(shù)碼照相功能［2］。

共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM)1990年Cavanagh 等首次將光學共焦顯微鏡應(yīng)用于臨床。因無創(chuàng)、動態(tài)的優(yōu)點在臨床和研究領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用。CLSM用激光作為光源，提高了分辨率，增加了掃描深度，能實時、活體和三維空間從細胞水平對角膜各層結(jié)構(gòu)定性分析研究。CLSM 下正常CEC 呈六邊形結(jié)構(gòu)，邊界清晰，排列規(guī)則，細胞透光性較一致，細胞核很難觀察到［3］。60 歲以上受檢眼中CEC 可見小塊無細胞暗區(qū)，病變CEC 腫脹，失去多邊形結(jié)構(gòu)，邊界模糊，細胞間隙增寬，細胞間可見大小不一，形態(tài)各異的KP，并可突破細胞間連接，出現(xiàn)細胞缺損區(qū)。

1.1.3 角膜內(nèi)皮顯微鏡(corneal specular microscopy，CSM)

目前有非接觸及接觸式兩種應(yīng)用于臨床。CSM 可觀察角膜多象限的CEC，可與視頻打印機、電腦、Cell Count、IMAGE net、Cell Analysis 等軟件配置分析處理圖像，能全面反映CEC 的狀態(tài)，使CEC 形態(tài)學研究有了很大飛躍。然而，CSM 也有其不足，Cheung［4］研究證明CSM 檢查存在著誤差。不同顯微鏡之間存在著差異［5］。在圖象分析上計算機識別細胞的界限存在一定誤差［6］;不能對壞死細胞進行剔除處理等。在圖像欠清晰時會將單個CEC 標記成兩個或數(shù)個細胞，在所選計數(shù)區(qū)域的邊緣，常常將不完整的單個細胞計算在內(nèi)，錯誤的描繪其邊界，甚至拍攝到的CEC 混濁不清或大片暗區(qū)也被錯誤地自動計數(shù)。

1.1.3 電子顯微鏡(electron Microscope，EM)

透射電子顯微鏡 (transmission electron Microscope，TEM)的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬～幾十萬倍。能提供極微細材料的組織結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和化學成分等方面的信息。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)利用電子束掃描樣品表面獲得樣品信息，能產(chǎn)生樣品表面高分辨率的三維圖像，鑒定其表面結(jié)構(gòu)。SEM 下正常CEC 為單層，細胞體積大而扁平，多邊形，表面微絨毛豐富，細胞間伸出足突相互連接［7］，細胞邊界的交叉角約為120°。TEM 下細胞核呈長橢圓形，核質(zhì)比高，核明顯偏向游離面，核仁大［8］，異染色質(zhì)沿核膜分布，常染色質(zhì)散在于核內(nèi)，胞漿內(nèi)見豐富完整的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等結(jié)構(gòu)。

1.2 眼前段光學相干光斷層掃描儀(anterior segment optical coherence tomography，AS -OCT)

AS-OCT 是一種非接觸、方便快捷、分辨率高的眼前節(jié)掃描技術(shù)，其軸向分辨率最高＜25 μm，可獲得直徑達16 mm、最深6 mm 的眼前節(jié)組織斷層細節(jié)，既可進行定性分析，又可定量檢測。可觀察角膜精確的結(jié)構(gòu)，尤其病變時角膜結(jié)構(gòu)的具體變化，如角膜后表面囊泡［9］。

2 CEC 形態(tài)學相關(guān)參數(shù)

2.1 中央角膜厚度(Central corneal thickness，CCT)

角膜厚度可反映整個角膜的功能，中央部最薄，平均為500 μm，周邊部約為1000 μm 左右。研究表明，角膜厚度、CEC 數(shù)量和形態(tài)以及角膜內(nèi)皮滲透系數(shù)有很好的相關(guān)性，而CCT 與CD 之間無相關(guān)性。動態(tài)觀察角膜厚度對CEC 損傷程度及其功能及預(yù)后評定有非常重要的意義。角膜厚度增加30%即出現(xiàn)明顯混濁;增加50%以上出現(xiàn)不可逆性混濁［10］;角膜厚度持續(xù)增加表明CEC 損傷呈進行性加重。

2.2 CEC 形態(tài)

正常CEC 呈六邊形，厚4～5 μm，寬18～20 μm，平均表面積約為400 μm2，大小相等，分布規(guī)則，細胞邊界的交叉角約為120°，CEC 受損或發(fā)生移行，這個角度即發(fā)生改變。隨著年齡增長，CD 下降，細胞形態(tài)隨之變化，大小不等、多形性細胞增多，平均面積增大，六角形細胞減少。細胞形狀和大小不均隨年齡增加輕度改變。角膜水腫、后彈力層皺褶形成時可見內(nèi)皮內(nèi)呈波浪狀或條狀隆起或凹陷。角膜內(nèi)皮層類滴狀贅疣為CEC 的退行性改變，在60、70、80 歲正常人出現(xiàn)的百分比分別為6%，12%，29%。正常細胞邊界呈清晰的暗的直線，有時可見幾個細胞出現(xiàn)雙邊，可能是光學上的陰影，無病理學意義［11，1］。

2.3 暗結(jié)構(gòu)及角膜后表面的形態(tài)

CSM和CLSM 檢查CEC 時，相鄰細胞之間和細胞內(nèi)可發(fā)現(xiàn)大小不等的暗結(jié)構(gòu)(暗區(qū))或亮結(jié)構(gòu)［12］，小的比一個細胞還小，大的可以成片。暗區(qū)由死亡細胞或角膜后表面不光滑的隆起如滴狀和類滴狀等在CEC和房水交界面的反光形成［13］。較大的暗結(jié)構(gòu)，多發(fā)生在CEC 病變時如后彈力膜結(jié)節(jié)，少數(shù)原因不明。亮結(jié)構(gòu)有可能為內(nèi)皮細胞核的反光，前房炎癥時在細胞表面的沉著物可形成高反光點。角膜內(nèi)皮后表面為CEC 與前房水相接觸的分界線，CLSM 下呈一暗色的條帶，內(nèi)皮細胞表面光滑，鏡下呈直線形。當CEC 受損時，細胞表面產(chǎn)生不規(guī)則的暗的分界線，呈波浪型或鋸齒形。

2.4 CD

嬰幼兒期細胞通過有絲分裂增殖，總數(shù)約為90～100 萬個，新生兒期CD 約為3500～4000個/mm2，出生后第一年CD 減低最快，以后速率降低，25 歲以后降低更明顯，每年以0.5% 的速度遞減［14］，成人階段約為2500～3200個/mm2。成人后CEC 則失去增殖能力，損傷區(qū)域由鄰近細胞擴展、移行來覆蓋，60 歲以后，CD 減少與年齡無相關(guān)性。當CD 下降至1000個/mm2時，為內(nèi)眼手術(shù)后發(fā)生失代償?shù)呐R界值。在一定的界限內(nèi)CD 與整體細胞離子泵功能之間的關(guān)系不明顯，不能充分顯示CEC 功能狀態(tài)［14］。中央CEC 表現(xiàn)出較強的衰老相關(guān)的屬性，兔CEC 培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)角膜中央部CEC 倍增時間長于周邊部而增殖力則弱于周邊部，推測具干性屬性細胞可能位于周邊［15］。角膜中央和周邊部CD 均隨年齡減少，老年人周邊部減少更明顯。

2.5 平均細胞面積(Save)，最大細胞面積(Smax)，最小細胞面積(Smin)

Save隨CD 下降而增大。Smax及Smin與Save差異越大，代表細胞變異越明顯。研究發(fā)現(xiàn)，CD 降低到正常的25%～45%，六角形細胞數(shù)目小于30%～40%及細胞面積增加3～4 倍可導(dǎo)致CEC 功能失代償［16］。

2.6 周長、最長徑、最短徑

細胞形態(tài)學參數(shù)的改變能反映早期CEC 的功能障礙。周長和最長徑反映細胞變化時的拉長程度;細胞最長直徑或面積測量值等如果過大，說明細胞有移行擴張現(xiàn)象，其功能必然受損，目前臨床儀器尚未能反應(yīng)這些指標。

2.7 細胞形狀H%

反應(yīng)CEC 偏離標準六邊形結(jié)構(gòu)的程度，為衡量細胞損害的靈敏指標。但其與CD 在整體CEC 功能狀態(tài)中所起的作用尚需進一步研究。形態(tài)系數(shù)Fc(Fc=4πA/Pe2)(A 為面積，Pe 為周長)，能準確反映細胞圓整程度，正圓形為1.0，正六邊形為0.907［17］。

3 CEC 形態(tài)學影響因素

3.1 遺傳

Makiti 認為遺傳因子決定CD 的成分大于環(huán)境影響，遺傳因子可通過決定出生時CEC 數(shù)目和角膜最終面積來決定CD［18］。CEC 數(shù)量和CD 存在種族差異、個體差異，并隨年齡而變化。西方成人CEC每年減少0.5%～0.6%，中國和印度成人為0.3%［19，20］?？赡芘c角膜生長過程中CEC 的重新分配有關(guān)，青少年階段CD 下降更明顯。左右眼無明顯差異，性別對CD 無影響。另外，CD 也存在地域差異，亞洲地區(qū)CD 高于其他地區(qū)［19，20］。

3.2 眼部疾病

3.2.1 近視

中低度近視眼CEC 各項檢查結(jié)果與正視眼無顯著差異。高度近視者CD 減少，與角膜厚度和眼軸長度無相關(guān)性，可能與以下因素［21］有關(guān):(1)早期細胞有絲分裂增強，角膜直徑增大;(2)玻璃體退行性變影響房水循環(huán)及代謝進而影響CEC 的營養(yǎng);(3)眼軸增大，角膜也會發(fā)生伸展，影響CD。這種狀態(tài)下，CEC 更易受到外傷、眼內(nèi)手術(shù)等各種理化因素的損傷而出現(xiàn)形態(tài)變異。此外佩戴角膜接觸鏡、提高視覺質(zhì)量的手術(shù)(分子激光、晶狀體眼人工晶狀體植入等)增加了CEC 損傷的機會。研究兒童和青少年近視組發(fā)現(xiàn)，不同程度的近視角膜厚度無明顯差異，Save與近視程度具有相關(guān)性。

3.2.2 角膜原發(fā)病變

(1)由原發(fā)性角膜內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致的角膜營養(yǎng)不良稱為角膜內(nèi)皮(后部)營養(yǎng)不良，包括Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)、多形性角膜后層營養(yǎng)不良(posterior polymorphous corneal dystrophy，PPCD)、先天性遺傳性角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(congenital hereditary endothelial dystrophy，CHED)。CEC 功能及形態(tài)異常、后彈力層后部可見由CEC 分泌的異常膠原等為其共同特征。FECD 以CEC 形態(tài)緩慢持續(xù)改變、細胞數(shù)量不斷減少及晚期出現(xiàn)角膜滴狀贅疣為特點［22］，內(nèi)皮鏡可見后彈力層增厚，出現(xiàn)多行贅疣;CEC 變大，多形，被贅疣排擠、推壓形成中間亮點周圍暗區(qū)。PPCD 特征性表現(xiàn)為CEC 上皮樣改變，包括CEC 出現(xiàn)復(fù)層增生并分泌一系列細胞角蛋白而這些角蛋白表達于角膜上皮細胞。CHED 由CEC 發(fā)育不全或變性、功能減退所引起，病理特征:細胞形態(tài)異常，可見異常的多核細胞。(2)Peters 異常以CEC和后基質(zhì)層和后彈力層缺損的缺損為特征，角膜中央部有先天性白斑，中央虹膜粘連到白斑的周邊部，虹膜與角膜粘連常位于顳側(cè)虹膜睫狀區(qū)。角膜可出現(xiàn)水腫，周邊部角膜比較透明。(3)ICE綜合征CEC 形態(tài)在病變早中期呈“風箏樣”、晚期呈“上皮細胞樣”特征性變化［23］;細胞核呈高反光或雙核，CD和H%隨病程逐漸下降，AVG 增大［24］。

3.2.3 青光眼

(1)原發(fā)性急性閉角型青光眼高眼壓可直接損傷CEC，房水循環(huán)阻滯使房水處于低氧狀態(tài)影響細胞代謝。細胞損傷與急性發(fā)作的持續(xù)時間有密切關(guān)系，表現(xiàn)為細胞面積增大和CD 下降，細胞受損程度與眼壓密切相關(guān)。(2)原發(fā)性慢性閉角型青光眼CD 減少與其急性發(fā)作史有關(guān)。(3)原發(fā)性開角型青光眼和正常對照組相比，CD 密度顯著減少，正常眼壓性青光眼患者的CD 則不降低［25］。

3.2.4 白內(nèi)障

目前多認為老年性白內(nèi)障發(fā)病機制是晶狀體上皮細胞發(fā)生退行性變，細胞膜通透性增加酶活性改變、細胞數(shù)量減少凋亡細胞增多。CEC 與晶狀體上皮細胞處于同一房水環(huán)境中，晶狀體上皮細胞凋亡時可能影響到CEC 正常代謝。老年性白內(nèi)障進展程度與CEC 密度和形態(tài)改變有一定相關(guān)性，隨著白內(nèi)障進展程度的加重，CD 降低，CV 增大，H%降低［26］。

3.2.5 葡萄膜炎

前葡萄膜炎炎癥急性期CEC 出現(xiàn)暗區(qū)，彼此間相互融合，CEC 形態(tài)發(fā)生改變，Save增大，SD 減少，細胞暫時性功能障礙?；謴?fù)期KP 數(shù)量減少，CEC表現(xiàn)為亮度不均的殘缺細胞形態(tài);炎癥平息后，細胞間隙漸清，細胞暗區(qū)逐漸消退，細胞輪廓逐漸顯現(xiàn);炎癥消退后CD 可能未見統(tǒng)計學意義上的改變，但是細胞形態(tài)學的改變不可逆轉(zhuǎn);CEC 損害與發(fā)病頻數(shù)呈正相關(guān)，與病程及疾病嚴重程度密切相關(guān)［27］。

3.2.6 角膜內(nèi)皮炎

這是一種病因不明的CEC 急性非化膿性炎癥，以深基質(zhì)水腫及角膜后沉著物(KP)為特征，CEC有不同程度損害，形態(tài)發(fā)生異常。CLSM 下CEC 前可見斑片狀大小不等的高反光結(jié)構(gòu)，部分可見“疣狀物”，病變區(qū)CEC 水腫、剝脫，變性呈無結(jié)構(gòu)暗區(qū)，細胞呈多形性改變;CEC 間炎癥細胞浸潤［28］，細胞間可見大小不一，形態(tài)各異的KP，并可突破細胞間連接，出現(xiàn)細胞缺損區(qū)。

3.3 糖尿病

高血糖下兔CEC 腫脹，表面出現(xiàn)裂紋，細胞間隙增大，連接疏松，微絨毛消失。形態(tài)學改變與葡萄糖濃度基本成正相關(guān)。糖尿病患者長期房水中葡萄糖的含量升高或不穩(wěn)定，CEC Na+-K+-ATP 酶活性降低，影響角膜葡萄糖代謝，導(dǎo)致乳酸濃度升高，產(chǎn)生角膜基質(zhì)代謝性酸中毒，進而引起CEC 形態(tài)和功能的改變，修復(fù)和代償能力下降，對眼部疾病、損傷及手術(shù)缺乏抵御和耐受能力，細胞易丟失。糖尿病人的CEC 形態(tài)改變具體表現(xiàn)為CCT、CV 增加，SD和H%減少［29］。

3.4 手術(shù)和外傷

內(nèi)眼手術(shù)對CEC 損傷包括熱灼傷、震蕩傷、機械損傷及化學損傷等。術(shù)者熟練程度、手術(shù)時間的長短、手術(shù)技巧、儀器的性能及眼內(nèi)外光、電、冷凝等直接或間接影響CEC，術(shù)中前房灌注液和高濃度的化學物質(zhì)刺激、玻璃體的溢出，術(shù)后前房無菌性滲出和高眼壓均對內(nèi)皮產(chǎn)生影響。內(nèi)眼手術(shù)后，SD 每年丟失率顯著增加。眼外傷時機械性外力對CEC的擠壓，前房積血，繼發(fā)性色素膜炎影響，均導(dǎo)致CD和H%降低，造成CEC 屏障功能和主動運輸功能的破壞。角膜穿通傷時，CEC 經(jīng)創(chuàng)面直接丟失。

3.5 角膜接觸鏡

慢性缺氧和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致乳酸堆積和CO2水平增高，PH 降低，引起細胞面積增大、CD、H% 減少。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)硬性角膜接觸鏡、日拋型軟性及軟性親水的水凝膠角膜接觸鏡均可引起CEC 形狀改變細胞大小不均的改變，如隨著戴鏡時間增加，CEC 面積大小變異明顯增加，細胞間暗區(qū)明顯，角膜變薄等。屈光優(yōu)良、舒適、輕薄、高透氧和少沉積是這一領(lǐng)域未來研究方向［30］。

3.6 藥物

很多滴眼液和眼內(nèi)注射藥物均可對CEC 造成不同程度的損傷。部分抗青光眼滴眼液中含損傷CEC 的氯銨［31］。皮質(zhì)類固醇對角膜外傷有減輕水腫作用的同時也對CEC 造成損傷，使CEC 變異系數(shù)變大，H%變?。?2］。有學者認為，內(nèi)眼術(shù)后硅油進入前房可能影響房水對CEC 營養(yǎng)供應(yīng)，角膜新陳代謝降低。另外，硅油和CEC 接觸會使細胞生理及形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)異形細胞和暗、亮結(jié)構(gòu)變異，也可見到后彈力層贅生物［33］。C3F8等眼內(nèi)填充氣體可產(chǎn)生一過性細胞毒性。腎上腺素、慶大霉素局部應(yīng)用，利多卡因前房內(nèi)注射都可不同程度損傷CEC。

3.7 其他

戶外工作者SD 減少可能與紫外線輻射增加有關(guān)［34］。原發(fā)性高血壓患者可能H% 下降、CV增大［35］。

不同的分析細胞形態(tài)學技術(shù)手段為臨床CEC評估提供了多種選擇方案。形態(tài)學定量和定性分析對了解CEC 功能狀況和代謝進程，進而指導(dǎo)眼科疾病的治療、判斷手術(shù)預(yù)后、預(yù)測術(shù)后修復(fù)情況等都極為重要。各種檢查技術(shù)開發(fā)、現(xiàn)有檢查技術(shù)升級及各種檢查技術(shù)的合理交叉應(yīng)用，綜合評估是這一領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

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