湯起武，蔣大良，劉崇靈，王淑琴，李潤(rùn)成，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 41012 8）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（PRV）引起的一種急性傳染病。感染豬的臨床特征為體溫升高，新生仔豬主要表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，還可侵害消化系統(tǒng)。成年豬呈隱性感染，妊娠母豬感染后可表現(xiàn)流產(chǎn)、死胎及呼吸癥狀。公豬表現(xiàn)為繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀［1］。本病的傳染源主要是帶毒豬和其它帶毒動(dòng)物，病豬可通過(guò)分泌物排出病毒，污染豬舍，使健康豬群感染［2］。本病也可以發(fā)生于其他家畜和野生動(dòng)物，在自然條件下能感染豬、牛、羊、犬、貓、兔、鼠、野豬、貂、熊、狐等動(dòng)物［3］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中家兔、豚鼠、小鼠都易感，其中以家兔最為敏感。

1 病例介紹

2012年6月，湖南岳陽(yáng)某500頭母豬的規(guī)模豬場(chǎng)，7-15日齡哺乳仔豬發(fā)病，體溫達(dá)41℃以上，皮膚略顯紅黃色。2天后2-7日齡小豬也出現(xiàn)發(fā)病癥狀，少數(shù)病豬有腹瀉癥狀，病豬均表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀，最后死亡；少數(shù)懷孕母豬出現(xiàn)體溫升高，食欲下降，至送檢當(dāng)天有6頭母豬出現(xiàn)了流產(chǎn)現(xiàn)象。豬場(chǎng)送檢了7-15日齡的發(fā)病小豬4頭，7日齡以下的發(fā)病小豬5頭。剖檢發(fā)現(xiàn)7-15日齡小豬病變不明顯，但7日齡以下小豬均表現(xiàn)腦膜有明顯出血點(diǎn)，肝、脾有白色壞死點(diǎn)，腎有針尖狀出血點(diǎn)，肺有出血點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的PRV gE基因序列（基因登錄號(hào)：M14336），應(yīng)用計(jì)算機(jī)Primer 軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增gE基因的特異性引物，目的片段大小為363bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列為：上游引物（gI/Efp）：TTGTGGGTGGCGTTTTATCTCCGTC；下游引物（gI/Erp）：AAGTTGGCGCCCTCGGACACGTTC。

2.2 病料樣品DNA 的提取

從5頭7日齡以下發(fā)病小豬病料中隨機(jī)選出4份，進(jìn)行PRV檢測(cè)，樣品DNA的提取參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

2.3 PRV的PCR擴(kuò)增

取設(shè)計(jì)的引物，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：基因組模板0.5μL，dNTP（2.5mmol/L） 0.5μL，上游和下游引物（10μmol/L）各1.5μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 酶1μL，5×Buffer10μL，加超純水至50μL。反應(yīng)條件為 ：98℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，70℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2.4 PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定并將所測(cè)出基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2.5 家兔接種實(shí)驗(yàn)

將6只家兔分成3組：1組接種病料組織，1組接種偽狂犬病毒商品疫苗，另設(shè)2只不接種任何物質(zhì)作為對(duì)照組。具體操作為：取2頭發(fā)病小豬腦組織和肝臟各1g，碾磨加5ml生理鹽水勻漿，離心后取上清加雙抗至2000單位/mL，無(wú)菌過(guò)濾備用。1頭豬的組織提取液作為一個(gè)樣本，分別接種2只家兔；疫苗接種組則按疫苗說(shuō)明書(shū)稀釋好疫苗后每只家兔接種10頭份生豬劑量的疫苗即可。所有家兔均采用皮下接種方法進(jìn)行接種。

2.6 病原分離鑒定

采集腦部病料，無(wú)菌操作將病料剪碎至1.5mL離心管中，加入適量含1%雙抗的1640培養(yǎng)基，反復(fù)凍融三次之后，用組織勻漿機(jī)研碎病料，4℃，12000r/min，離心15min，取上清0.9mL接種單層PK-15細(xì)胞，37℃感作1h后加入含2%新生牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱3-5d，觀察細(xì)胞病變情況，并設(shè)正常對(duì)照組。

3 結(jié)果

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以從病料中提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)4個(gè)樣品均擴(kuò)增出了預(yù)期大小的目的片段。

3.2 測(cè)序結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)出序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示為偽狂犬病毒gE基因，與偽狂犬病毒LA株序列（登錄號(hào)：AY683135）同源性達(dá)99%。

3.3 家兔接種實(shí)驗(yàn)

用病料和疫苗接種家兔48h后，病料接種組的家兔出現(xiàn)了瘙癢癥狀，將接種部位全部咬傷（圖2），在出現(xiàn)瘙癢癥狀3-4h后死亡。對(duì)照組家兔以及疫苗接種組家兔沒(méi)有任何異常表現(xiàn)。

圖1 PRV PCR擴(kuò)增結(jié)果

測(cè)出序列：

圖2 病料接種組的家兔

3.4 病原分離鑒定

將病料接種細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)從24h后有些細(xì)胞變圓、固縮，48h后出現(xiàn)明顯細(xì)胞拉網(wǎng)現(xiàn)象并有大部分細(xì)胞脫落（圖3），而正常細(xì)胞對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)病變（圖4）。將接毒48h后的細(xì)胞液反復(fù)凍融三次后，取細(xì)胞液提取DNA進(jìn)行PRV的PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)接毒細(xì)胞擴(kuò)增出了約363bp的特異性條帶，正常細(xì)胞未見(jiàn)到任何條帶。

圖3 病變細(xì)胞

圖4 正常細(xì)胞

圖5 接毒細(xì)胞PRV檢測(cè)結(jié)果

4 討論

自1947年我國(guó)首次報(bào)道偽狂犬病以來(lái)，已有20多個(gè)省、市、自治區(qū)相繼報(bào)道過(guò)本病。總結(jié)1998-2007年全國(guó)各地區(qū)PR野毒感染抗體（gEELISA）流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道，全國(guó)PRV豬群感染平均陽(yáng)性率達(dá)20.85%，而湖南為39.59%，高于全國(guó)平均水平［5］。根據(jù)湖南省畜牧局、湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心和湖南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所聯(lián)合發(fā)布的2001-2008年湖南豬群主要疫病流行態(tài)勢(shì)與分析顯示：近些年來(lái)豬偽狂犬病仍是我省傳統(tǒng)的主要生豬疫病之一，200l-2006年檢測(cè)結(jié)果顯示，每年有20%以上的病例為豬偽狂犬病，2007年和2008年受高致病性豬藍(lán)耳病疫情的掩蓋，受檢樣品減少，但樣品陽(yáng)性率依然保持較高比例，表明其危害程度依然較高［6-7］。邱美珍等自2011年1—11月，先后從湖南省19個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)采集1096份種豬血清、551份仔豬和肥育豬血清樣本，利用gE-ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）方法對(duì)湖南省19個(gè)使用偽狂犬病gE基因缺失疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行野毒血清抗體的監(jiān)測(cè)與全面分析，結(jié)果共檢出12份陽(yáng)性樣本，總樣品陽(yáng)性率為0.73%，4個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)到偽狂犬病野毒抗體，豬場(chǎng)陽(yáng)性率21.05%；顯示偽狂犬病仍在湖南省呈地方性流行。但與2008年之前相比，其感染率已經(jīng)有所下降［8］。

疫苗接種不到位，生豬免疫抗體出現(xiàn)長(zhǎng)期的空白期，豬場(chǎng)老鼠猖獗，都可引起發(fā)該病發(fā)生及傳播。因此筆者認(rèn)為在當(dāng)前的疾病感染壓力下，使用優(yōu)質(zhì)的gE基因缺失疫苗強(qiáng)化免疫是控制和凈化偽狂犬病的重要手段，同時(shí)要加強(qiáng)生物安全措施、注重后備豬的選擇、加強(qiáng)定期監(jiān)測(cè)工作，采取綜合防控才能使我國(guó)偽狂犬病的流行態(tài)勢(shì)得到根本好轉(zhuǎn)。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：218.

[2] 李雄志.豬偽狂犬病的診斷與防治[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2002，19（11）：27-27.

[3] 鄔蘇曉，劉鎮(zhèn)明，肖正中，等.淺談我國(guó)豬偽狂犬病的凈化[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2004，21（6）：29-30.

[4] 婁高明，費(fèi)恩閣，宣華，等.PRV閩A株Bam HI片段克隆及其第7片段的鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，16（2）： 108-112.

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[6] 劉道新，邱伯根，魯杏華，等.2001-2008年湖南豬群主要疫病流行態(tài)勢(shì)與分析[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2009：917-921.

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