藍勝芝，徐素珍，李寶臣，曹玉飛，趙艷敏，金順福

（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310018）

傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是一種由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的急性、高度接觸性傳染病，常導(dǎo)致雞群的大量死亡，同時導(dǎo)致免疫抑制[1]，使得雞群疫苗接種免疫失敗而導(dǎo)致繼發(fā)、并發(fā)疾病大量增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前常用的防治手段是疫苗接種，包括減毒疫苗和滅活疫苗，但自IBDV發(fā)現(xiàn)至今，新的變異株、強毒株、超強毒株不斷出現(xiàn)[1]，分子結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致病毒致病力的改變及宿主對疫苗應(yīng)答的改變，使得傳統(tǒng)疫苗已不能控制其流行，給疾病的預(yù)防與治療帶來新的困難與挑戰(zhàn)。

傳染性法氏囊亞單位疫苗的研究目前主要是基于大腸桿菌[2]和酵母這兩種表達系統(tǒng)。比較細(xì)菌和酵母這兩種宿主細(xì)胞的特性，酵母的優(yōu)勢非常明顯[3]。甲醇畢赤酵母表達系統(tǒng)在所有表達系統(tǒng)中表達量最高，文獻報道有高達12g/L，該系統(tǒng)能將表達的重組蛋白進行精確翻譯后加工修飾，接近于天然蛋白。分泌型酵母表達載體能將目的蛋白分泌到發(fā)酵上清液中，而酵母自身的本底蛋白大部分都留在細(xì)胞中，免去了沉淀破碎和純化等繁雜的后續(xù)處理。本研究中我們將雞傳染性法氏囊?。↖BD）超強毒株（vvIBDV）主要免疫原性基因VP2借助表達載體pPICZαA使目的基因整合到畢赤酵母X-33染色體中，對VP2重組蛋白在畢赤酵母中的高效分泌表達進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

vvIBDV 強毒株由本室分離并保存；大腸桿菌JM109由本實驗室保存；受體菌株P(guān)ichia pastoris X-33（His- Mut+）、表達載體pPICZαA和抗生素ZeocinTM購自Invitrogen公司。

1.1.2 引物

上游引物（5’- CACTCGAGAAAAGAATGA CAAACCTGCAA -3’）和下游引物（5’-TAGCGGCC CTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT-3’），由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 其它

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、高保真Taq DNA 聚合酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自大連寶生物工程公司；配制培養(yǎng)基用酵母抽提物、水解乳蛋白、YNB、生物素等分別購自英國OXIOD 公司與Sigma 公司；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴增

參考已報道的vvIBDV的VP2基因序列，應(yīng)用Oligo5.0軟件在基因上下游設(shè)計一對引物。上游引物中引入酶切位點XhoI和蛋白酶KEX2的切割序列，下游引物中引入NotI酶切位點和終止密碼子TAA。引物序列分別是：

上游引物 ：5’-CACTCGAGAAAAGAATGACA AACCTGCAA-3’

下游引物：5’-TAGCGGCCGCTTACCTTAG GGCCCGGATTATGT-3’

下劃線分別是XhoI、Not I酶切位點。斜體為蛋白酶KEX2的切割序列。此構(gòu)建原因一：當(dāng)重組蛋白由信號肽引導(dǎo)從胞內(nèi)分泌至胞外時，經(jīng)信號肽蛋白切割酶切割后，在目的蛋白的N端不會殘留多余的氨基酸，從而不影響其天然免疫原性。原因二：在下游引物中添加TAA終止密碼子，使得重組蛋白只表達VP2蛋白，而不帶有酵母載體自身的c-myc epitope抗原表位和六組氨酸標(biāo)簽polyhistidine tag，使目的蛋白保持天然活性。

應(yīng)用RT-PCR方法，從國內(nèi)雞傳染性法氏囊?。↖BV）眾多流行株中分離出超強毒株（vvIBDV）中擴增得到IBDV主要保護性抗原VP2基因的開放編碼框。

1.2.2 酵母表達載體的構(gòu)建

將擴增純化后的目的基因VP2與表達載體pPICZαA分別用XhoI/NotI進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠回收純化，用T4連接酶進行連接反應(yīng)，得到的重組表達質(zhì)粒命名為pPICZαA-VP2。將該重組表達質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，并在含有抗生素Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基中分離得到陽性克隆。試劑盒提取質(zhì)粒，利用XhoI/NotI對pPICZαA-VP2 重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，利用pPICZαA載體兩端的5’AOX1、3’AOX1 引物以及目的基因上下游引物進行PCR鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司測序驗證。

1.2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)畢赤酵母

按Invitrogen Pichia操作指南制備Pichia pastoris X-33感受態(tài)。取100μL感受態(tài)細(xì)胞與10μL（7-10μg）SacⅠ線性化的重組表達質(zhì)粒混合，注入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min于Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀2.0KV、5ms條件下電轉(zhuǎn)化后，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，轉(zhuǎn)移到小試管中30℃靜置1h，取50、100、200μL菌液涂布于YPDS（Zeocin 100μg/mL）抗性選擇平板上，30℃倒置培養(yǎng)2-3d，直至克隆長出。

1.2.4 高抗性（拷貝）重組菌株的篩選

載體pPICZαA中含有Zeocin抗性基因，根據(jù)文獻報道，重組酵母菌株抵抗Zeocin的能力與其整合質(zhì)?？截悢?shù)成正比，因此，用含有不同Zeocin濃度（100μg/mL -3000μg/mL）的瓊脂平板可以快速篩選含多拷貝外源基因轉(zhuǎn)化株。

具體操作方法是：用滅菌牙簽挑取在Zeocin濃度為100μg/mL的電轉(zhuǎn)平板上的單菌落，將其分別點種在Zeocin濃度為1000μg/mL、2000μg/mL、3000μg/mL的YPDS平板上。將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)2-3d。按菌落長勢大小，從大到小挑取Zeocin濃度為3000μg/mL的YPDS平板上的20株單克隆。將此20株單克隆分別劃線Zeocin濃度為100μg/mL的YPDS平板，以純化單克隆。

1.2.5 PCR鑒定陽性克隆及其表型

外源基因整合酵母染色體的方式有兩種，分別是置換重組和交叉重組，這兩種重組方式相應(yīng)產(chǎn)生兩種不同的菌株分別是甲醇利用緩慢型菌株（Muts）和甲醇利用快速型菌株（Mut+）。鑒定這兩種表型，較為簡便的鑒別方式是PCR方法。利用表達載體的兩端引物5'AOX1、3'AOX1進行PCR鑒定，若PCR擴增產(chǎn)物為單一片段，大小為2.0kb，則為慢速生長型轉(zhuǎn)化子，緩慢利用甲醇；若PCR擴增產(chǎn)物除了1.3kb左右的目的基因外，還有一條約2.2kb大小的基因片斷，則為快速型轉(zhuǎn)化子，能夠快速利用甲醇。

1.2.6 搖瓶誘導(dǎo)表達

將重組菌和空載體轉(zhuǎn)化酵母菌單克隆分別接種于100 mL的BMGY培養(yǎng)基中，28-30℃，250-300 r/min培養(yǎng)至菌體OD600值為2-6，1500-3000g，室溫離心5 min收集菌體。菌體沉淀用20mL BMMY培養(yǎng)基重懸，于28-30℃，250-300 r/min培養(yǎng)4-5 d，每隔24 h補加甲醇至終濃度為1%，并在0、24、48、60、72、84、96、108、120 h分別取少量的培養(yǎng)上清和菌體，以確定表達的最佳時間。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min，分別收集上清和沉淀，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 SDS-PAGE及Bradford法蛋白濃度測定

經(jīng)SDS-PAGE檢測有VP2表達的上清進行Bradford蛋白濃度測定，參照試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，以A595nm測定的OD值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測樣品，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。

1.2.8 表達蛋白的Westren-Blot鑒定

經(jīng)SDS-PAGE檢測有VP2表達的上清進行Western Blot鑒定。分別取不同時間表達上清液20μL，于12%的SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后的聚丙烯酰胺凝膠通過電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（BioRad）以200mA，1h的參數(shù)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。電轉(zhuǎn)完畢加入封閉液（5%脫脂奶粉于PBS中）4℃靜置過夜，第二天取出于室溫緩搖1h；用TBST洗膜，加入雞法氏囊多克隆抗體（1：120稀釋）室溫緩搖2h，用TBST洗膜，加入含適量二抗（兔抗雞1∶400）的Dilution Buffer，室溫孵育1h；用TBST洗膜，DAB顯色，待蛋白帶的顏色達到要求（約10min），以水漂洗，終止顯色，拍照記錄。

1.2.9 表達蛋白的免疫原性鑒定

取不同時間發(fā)酵上清液，經(jīng)乳化后，以肌肉注射的方式免疫21日齡雞，免疫劑量為0.5ml/只；免疫后每周采集血清（共采血26周，其中第13周后改為每個月采血1次），應(yīng)用Biochek 傳染性法氏囊抗體檢測試劑盒（ck113）進行檢測，觀察抗體變化規(guī)律，同時設(shè)空載體表達的發(fā)酵上清液作為對照。結(jié)果判斷依據(jù)為：S/P＝（待檢樣品平均值－陰性對照平均值）/（陽性對照平均值－陰性對照平均值。若S/P≤0.149 為陰性，S/P＝0.150～0.199為可疑，S/P≥0.200 為陽性。

2 結(jié)果

2.1 含目的基因VP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

應(yīng)用RT-PCR法從分離得到的vvIBDV中擴增獲得目的基因，依次為模板進行PCR擴增，并純化回收，電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小約為1359 bp，與預(yù)期大小一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物用XhoⅠ、NotⅠ雙酶切，克隆至載體質(zhì)粒pPICZαA強啟動子PAOX1下游的XhoⅠ和NotⅠ雙酶切窗口中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαAVP2。通過XhoⅠ、NotⅠ酶切pPICZαA-VP2進行鑒定，得到大小兩個片段，大片段約為3.6 kb，包含載體pPICZαA的大部分序列；小片段約為1359bp，為含VP2基因的片段。由酶切鑒定的結(jié)果可知，pPICZαA-VP2為所需的重組質(zhì)粒（圖2）。

2.2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

將上述鑒定正確的重組質(zhì)粒送至Invitrogen測序，測序結(jié)果翻譯成氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，VP2 ORF中含有超強毒株所具有的富含絲氨酸的保守七肽區(qū)[4]（S-W-S-A-S-G-S），此外在其親水區(qū)第222、256、294和299位置上分別是超強毒株所特有的A、A、I、S，而一般弱毒株則相應(yīng)是另外四個氨基酸P（或Q或T）、V、L、N。所以可以確定實驗得到的是超強毒株（vvIBDV）的VP2基因，這對目前已經(jīng)流行的超強毒株傳染性法氏囊病的控制有著重要意義。

分析VP2基因N端序列，已經(jīng)成功融合了pPICZaA 載體分泌信號肽下游的蛋白酶KEX2和STE13切割位點，保證VP2蛋白能從信號肽上成功切割，并不會殘留多余氨基酸而影響其抗原性。在VP2 C 端添加終止子TAA后，已去除載體上的c-myc epitope和 polyhistidine tag。

2.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母

重組質(zhì)粒pPICZαA-VP2經(jīng)SacⅠ酶切線性化后（圖3），經(jīng)DNA Fragment Puri fi cation Kit純化濃縮后，于Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀上高壓脈沖電流轉(zhuǎn)化宿主菌巴斯德畢赤酵母X-33，轉(zhuǎn)化物涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS板上，28℃培養(yǎng)2-3 d，直至克隆長出。

2.4 PCR鑒定陽性克隆及表型

通過載體測評5’AOX1/3’AOX1進行PCR來鑒定表型（圖4）。經(jīng)電泳結(jié)果顯示大部分工程菌是Muts，即重組質(zhì)粒整合到宿主染色體上的方式是置換重組，也稱雙位點交換（double crosscover），發(fā)生在染色體AOX1（或aox1:ARG4）位點和表達質(zhì)粒中的PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。含PAOX1、外源基因和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的表達單位置換了染色體上完整的有功能的AOX1基因，因此產(chǎn)生的表達菌的表型為His+Muts（AOX1-AOX2+）。

2.5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

按搖瓶培養(yǎng)方法對基因工程菌用5g/L甲醇濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)120h。在120h的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，隨著誘導(dǎo)時間的增長，目的蛋白表達量也逐漸增多，96h顯著提高，之后目的蛋白量基本不變（圖5）。根據(jù)理論推算，比蛋白理論值分子量（49.8 kDa）大的66kDa應(yīng)為糖基化的VP2。

2.6 Bradford法測定蛋白濃度

圖5 分泌型表達菌株在不同發(fā)酵時間所得的蛋白上清的SDS PAGE分析

圖6 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

將96h收獲的表達上清液，經(jīng)10倍稀釋后，于562 nm處測吸光度值為0.2317，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品總蛋白濃度為1.53 mg/mL（圖6）。對目的蛋白條帶用Image Master VDS系統(tǒng)進行掃描處理，得到目的蛋白占表達上清總蛋白百分含量為30%，因此最終目的蛋白濃度約為0.459mg/mL。

2.7 表達產(chǎn)物的Western Blot檢測鑒定

將不同時間收獲的表達上清進行Western Blot鑒定（圖7）。結(jié)果表明，重組酵母工程菌表達的目的蛋白可以與法氏囊陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，該蛋白具有雞傳染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性。

2.8 表達產(chǎn)物的免疫原性鑒定

將不同時間發(fā)酵上清液免疫雞后采血檢測抗體產(chǎn)生情況，以空載體表達的發(fā)酵上清液沒有誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生中和性抗體，這可以說明，中和性抗體完全是由IBDV 主要保護性抗原VP2蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生。同時96h表達產(chǎn)物抗體水平的均一度較120h要好（即變異度更低）（圖8）。96h和120h表達產(chǎn)物都在一免后2周左右即產(chǎn)生保護性中和抗體，從長時間檢測情況來看，雞組抗體水平呈有規(guī)律的動態(tài)變化，到后期呈緩慢下降趨勢，亞單位疫苗在雞體內(nèi)刺激產(chǎn)生中和抗體的維持時間較長，具有較好的免疫原性。

圖7 分泌型表達菌株在不同發(fā)酵時間所得的蛋白上清的Western blot分析

圖8 間接ELISA法鑒定表達產(chǎn)物免疫原性

3 討論

酵母表達載體pPICZαA上的α-factor信號肽包含83個氨基酸的前導(dǎo)肽及后面的一段由Lys-Arg -Glu-Ala-Glu-Ala氨基酸序列組成的間隔肽，α-factor成熟信號肽序列加工分兩步，先是膜結(jié)合蛋白酶KEX2在Lys-Arg *Glu-Ala-Glu-Ala中所示的星號位置即Arg及Glu之間進行切割，接著蛋白酶STE13切割Glu-Ala重復(fù)序列，即序列Glu-Ala*Glu-Ala*中星號所示位置。圖9是α-factor信號肽部分序列，其中小黑三角符合就是表示這兩種酶的切割位置）。前導(dǎo)肽和間隔肽對蛋白的正確切割和分泌至關(guān)重要，但有時由于上述兩種基因產(chǎn)物的切割活力不同，會在外源蛋白的N 端產(chǎn)生不同的切割位點，許多情況下，Stel13切割Glu-Ala重復(fù)序列的效率不高，使一些蛋白在分泌中會在N端殘留有（ Glu-Ala）1-2融合序列，即產(chǎn)生了所謂的酵母信號肽切割不完全現(xiàn)象，這可能會影響外源蛋白的活性。

圖9.α-factor信號肽部分序列意圖

為了獲得具有天然活性的目的蛋白，我們做了以下設(shè)計：其一，在VP2蛋白N端融合了酵母表達載體pPICZαA上α-factor信號肽下游的四個氨基酸序列（Leu-Glu-Lys-Arg），前兩個氨基酸序列是限制性內(nèi)切酶XhoI的酶切位點，后兩個氨基酸序列是膜結(jié)合蛋白酶KEX2的切割序列，即本研究中VP2蛋白只融合了其中一個蛋白酶KEX2的切割序列AAA-AGA（Lys-Arg），這樣設(shè)計避免了STE13可能導(dǎo)致的不完全切割，保證表達的VP2蛋白能從信號肽上完全切割下來，不會殘留多余氨基酸而影響其抗原性，保持蛋白的完整性和天然活性；其二，在VP2基因3'端添加終止子TAA，從而去除了載體上的兩段序列c-myc epitope和polyhistidine tag，同樣使得表達的目的蛋白不會殘留除了自身以外的其他多余序列。

畢赤酵母常用的菌株有KM71H、GS115、X-33[5]，這三種都為甲醇營養(yǎng)型酵母菌，具有不同的基因組型，外源基因插入時有不同的整合和重組方式，對于不同的重組質(zhì)粒其表達效果也各不相同，因此本研究對這三個菌株都進行了轉(zhuǎn)化篩選，根據(jù)轉(zhuǎn)化子生長情況和蛋白表達量的高低，我們選擇了X-33作為本研究中目的基因IBDV-VP2的最佳宿主菌。

因電轉(zhuǎn)時電壓的設(shè)置，電轉(zhuǎn)時間及質(zhì)粒的濃度，感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)都對電轉(zhuǎn)化效果影響較大，所以需要摸索電轉(zhuǎn)化的最適電轉(zhuǎn)儀參數(shù)，選擇最適的質(zhì)粒濃度和感受態(tài)細(xì)胞濃度。參考文獻資料[6-8]并進行了多次實驗摸索，本實驗采用以下電轉(zhuǎn)參數(shù)：0.2cm電轉(zhuǎn)杯，電壓2.0KV，電擊時間5ms。最佳質(zhì)粒濃度為：7μg到10μg（體積控制在10μL），感受態(tài)細(xì)胞100μL。在操作時，控制最后加入1M山梨醇的量，使得細(xì)胞濃度稍微有些粘稠為最好。另外，在加入1mL 0℃的1M山梨醇，30℃靜置復(fù)蘇1h后，再加入1mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃、200r/min振蕩復(fù)蘇1 h，這樣電轉(zhuǎn)效果會更好。以上電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化解決了產(chǎn)生假陽性克隆，陽性克隆少，質(zhì)粒穩(wěn)定性低，拷貝數(shù)低等在轉(zhuǎn)化時較常出現(xiàn)的問題。

本研究結(jié)果表明，VP2蛋白能順利高效地分泌到培養(yǎng)基中，且動物實驗結(jié)果顯示表達的重組蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗體，這為未來該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化研究工作打下了一定的基礎(chǔ)，但仍有許多方面需要進行摸索優(yōu)化，對表達條件的優(yōu)化以及Pichia pastoris表達系統(tǒng)的認(rèn)識還需進行進一步的探討。

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