張 毅 苗 玲 蘇 敏 蔡 琰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200127

本文進(jìn)一步分析硫辛酸對(duì)內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的影響，以探討硫辛酸抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和設(shè)備 硫辛酸（純品原料）有上?，F(xiàn)代制藥有限公司提供，所用細(xì)胞株是美國(guó)新墨西哥洲洲立大學(xué)Davise教授饋贈(zèng)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞A2（NBA2）。高糖改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、0．25%胰蛋白酶（含 EDTA）、磷酸緩沖液（PBS）為美國(guó)invitrogen公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白、胰島素是Sigma公司產(chǎn)品；DMSO是AMRESCO公司產(chǎn)品；MTT和小牛血清購(gòu)自上海華美生物公司；GSH分析試劑和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：TABAI MFG．有限公司（日本）；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠（中國(guó)）；Nicon倒置相差顯微鏡：Nicon公司（日本）；Bio－Rad 680酶標(biāo)儀：Bio－Rad公司（美國(guó)）；7200分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司（中國(guó)）。

1．2 培養(yǎng)液準(zhǔn)備 牛血清培養(yǎng)液（BD）：DMEM中含小牛血清10%，pH 7．2，無血清培養(yǎng)液（AI）：DMEM 中含500mg牛血清白蛋白和5mg胰島素，pH 7．2。含硫辛酸培養(yǎng)液（LA）：在AI中加入硫辛酸，配制成含100μmol／L硫辛酸的無血清培養(yǎng)液。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng) 依據(jù)實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)細(xì)胞老化模型建立方法［1］，采用無血清培養(yǎng)液（AI）在96孔培養(yǎng)板和25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)NBA2細(xì)胞。設(shè)立硫辛酸實(shí)驗(yàn)組（LA組）和無血清對(duì)照組（AI組），LA組培養(yǎng)液為含100μmol／L硫辛酸的AI培養(yǎng)液，2組均設(shè)5d、10d和15d時(shí)間組；細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．4 用MTT法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù) 接種在96孔板中各組細(xì)胞（1．0×104個(gè)／孔）培養(yǎng)至5d、10d和15d時(shí)同時(shí)終止培養(yǎng)，各孔中加入新鮮配制的5mg／mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，然后去除溶液，每孔中加入150μL DMSO，震蕩10min溶解結(jié)晶，最后在酶標(biāo)儀上用570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度，吸光度的大小反映了存活的細(xì)胞數(shù)量。以5d對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞存活率定為100%，其他各組吸光度與之相比，得到細(xì)胞相對(duì)存活率。每組重復(fù)8次，取平均值。

1．5 測(cè)定GSH含量 接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞（7×105個(gè)／瓶）在培養(yǎng)至5d、10d和15d時(shí)終止培養(yǎng)，各組細(xì)胞用0．25%胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，3次凍融破碎細(xì)胞，取各組細(xì)胞上清液用比色法測(cè)定并計(jì)算GSH含量（具體操作按照試劑盒說明書），各組均重復(fù)5次，取平均值，同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量（按試劑盒說明操作）。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行ANOVA分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 硫辛酸對(duì)老化的實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響 100 μmol／L LA實(shí)驗(yàn)組和AI對(duì)照組細(xì)胞存活率見表1。

2．2 硫辛酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)GSH水平的干預(yù) 各組細(xì)胞內(nèi)GSH含量見表2。

表1 硫辛酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞老化過程中細(xì)胞存活率的影響 （n＝8，±s，%）

表1 硫辛酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞老化過程中細(xì)胞存活率的影響 （n＝8，±s，%）

注：與同時(shí)期對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組別5d 10d 15d AI對(duì)照組100．00±14．79 75．45±10．78 28．54±3．13 LA組 212．48±12．22＊ 200．55±28．29＊ 96．81±14．46＊

表2 硫辛酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞老化過程中細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響 （重復(fù)次數(shù)n＝5，xˉ±s）

3 討論

谷胱甘肽（GSH）和超氧化歧化酶（SOD）是細(xì)胞內(nèi)重要的清除自由基、抗氧化損傷的物質(zhì)，SOD能促使超氧陰子自由基變?yōu)檠醴肿雍瓦^氧化氫，并通過其他酶系的進(jìn)一步作用而清除，抵抗膜脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害。GSH是細(xì)胞內(nèi)一種低分子量硫醇抗氧化劑，主要通過兩種ATP依賴酶（γ－谷氨酰胱氨酸連接酶，GSH合成酶）合成，作為重要的內(nèi)源性抗氧化劑，在清除過多ROS，保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷方面起關(guān)鍵作用。這些內(nèi)源性抗氧化劑反映了細(xì)胞自身的抗氧化能力。

我們以往研究結(jié)果提示，硫辛酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠減少老化細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化損傷；在抗氧化分析中，雖然發(fā)現(xiàn)對(duì)SOD活性有一定的提升作用，但是其對(duì)SOD的作用并不顯著［2］。本文繼續(xù)采用已建立的神經(jīng)細(xì)胞老化模型，進(jìn)一步分析硫辛酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑GSH的作用。結(jié)果顯示，盡管老化過程中GSH水平也明顯下降，但是與對(duì)照組比較，硫辛酸能顯著提高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱苷肽水平。結(jié)果說明硫辛酸具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑GSH水平提高的作用。我們已經(jīng)知道硫辛酸自身具有超強(qiáng)的抗氧化能力，是許多其他抗氧化劑所不能及的［3－4］。我們的結(jié)果提示硫辛酸可能通過直接清除ROS和調(diào)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)在抗氧化劑雙重作用保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激。Jia等［5］在SHSY5Y細(xì)胞上的研究同樣得到硫辛酸能通過上調(diào)GSH等內(nèi)源性抗氧化分子保護(hù)細(xì)胞。

細(xì)胞老化的基本特征之一是細(xì)胞內(nèi)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物的積聚增多，公認(rèn)的老化指標(biāo)——脂褐素的形成與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積聚密切相關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞老化涉及到與ROS相關(guān)的氧化應(yīng)激［6］。氧化損傷是老化和與老化相關(guān)的許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要因素［7－8］。因此抗氧化越來越成為抗老化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和預(yù)防及治療與老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的重要策略和措施，相關(guān)藥物在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中應(yīng)用越來越廣泛［9］。

硫辛酸作為外源性抗氧化劑，對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的提升以及對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用除了與直接清除ROS、自身抗氧化功效有關(guān)外，對(duì)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的誘導(dǎo)也值得關(guān)注。

（致謝：感謝上海現(xiàn)代制藥股份有限公司對(duì)本工作的大力支持和幫助）

［1］蔡琰，沈金坤，陸榮華 ．神經(jīng)細(xì)胞老化實(shí)驗(yàn)研究模型：無血清條件下培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞［J］．實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1985，18（6）：453－458．

［2］張毅，苗玲，蘇敏，等 ．硫辛酸在神經(jīng)細(xì)胞老化過程中的細(xì)胞保護(hù)作用研究［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2009，29（13）：1 161－1 163．

［3］Trujillo M，Radi R．Peroxynitrite reaction with the reduced and the oxidized forms of lipoic acid：New insight into the reaction of peroxynitrite with thiols［J］．Arch Biochem Biophys，2002，397：91－98．

［4］Navari－Izzo F，Quartacci MF，Sgherri C．Lipoic acid：a unique antioxidant in the detoxification of activated oxygen species［J］．Plant Physiol Biochem，2002，40：463－470．

［5］Jia Z，Hallur S，Zhu H，et al．Potent upregulation of glutathione and NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1by alpha－lipoic acid in human neuroblastoma SH－SY5Ycells：protection against neurotoxicant－elicited cytotoxicity［J］．Neurochem Res，2008，33（5）：790－800．

［6］Barja G．Aging in vertebrates and the effect of caloric restriction：a mitochondrial free radical production－DNA damage mechanism［J］．Biol Rev Camb Philos Soc，2004，79（2）：235－251．

［7］Gustavo Barja．Free radicals and aging［J］．Trends in Neurosciences，2004，27：595－600．

［8］Trushina E，McMurray CT．Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases［J］．Neuroscience，2007，145（4）：1 233－1 248．

［9］宋妤 ．依達(dá)拉奉在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用［J］．中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2008，11（12）：131－133．