陳長(zhǎng)廣，倪才方，陳 瓏

目前肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcathater atery chemoemblization，TACE）聯(lián)合射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）已成為治療不可切除肝癌的有效方法，可以提高對(duì)肝癌的治療效果[1-5]，但也存在不足之處，由于受三維空間的限制而易導(dǎo)致腫瘤殘留等，對(duì)大肝癌的治療常不徹底。殘余腫瘤的生物學(xué)行為變化與患者的預(yù)后有很大的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)聯(lián)合治療后兔肝癌殘余腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和微血管密度（MVD）表達(dá)，觀察其對(duì)殘余腫瘤組織血管生成的影響，并探討其治療肝癌的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用4～5月齡新西蘭大白兔（由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重2.0～2.5 kg，雌雄不限。動(dòng)物VX2腫瘤細(xì)胞株為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2肝癌模型制作和分組 按參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法，在CT引導(dǎo)下采用經(jīng)皮穿刺瘤塊推注法成功制作兔VX2肝癌模型。模型建好后3周行CT平掃和增強(qiáng)檢查，選取腫瘤直徑為2.5～2.7 cm的45只瘤兔，隨機(jī)分為對(duì)照組（假性治療組）、單純RFA組和TACE聯(lián)合RFA組（聯(lián)合治療組），每組15只。每組在治療后1、4、7 d分別各處死5只瘤兔。

1.2.2 TACE治療 荷瘤兔麻醉后，仰臥于DSA機(jī)床上，切開(kāi)股動(dòng)脈后引入4 F H1導(dǎo)管及3 F微導(dǎo)管，超選擇至肝固有動(dòng)脈，造影可見(jiàn)粗大的腫瘤供血?jiǎng)用}及網(wǎng)片狀腫瘤染色（圖1）。在透視下40%碘化油0.2～0.4 ml栓塞至腫瘤染色消失。術(shù)后予以預(yù)防感染、補(bǔ)液。

1.2.3 RFA治療 荷瘤兔麻醉后，仰臥于自制金屬手術(shù)車(chē)上，于上腹部正中切開(kāi)并充分暴露肝臟腫瘤結(jié)節(jié)，將射頻針插入腫瘤中央后消融10 min，功率25 W。對(duì)照組開(kāi)腹后在直視下將射頻針插入腫瘤中心部位，不接射頻發(fā)生器，10 min后拔除射頻針，關(guān)腹；單純RFA組僅進(jìn)行射頻治療。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用裸露端長(zhǎng)為2 cm的冷循環(huán)單極射頻針進(jìn)行治療（消融直徑最大為2 cm），故治療后會(huì)出現(xiàn)消融周邊區(qū)的腫瘤殘余。

1.2.4 聯(lián)合治療 TAE治療7 d后再行RFA治療。聯(lián)合治療后行增強(qiáng)CT檢查示腫瘤中心壞死無(wú)強(qiáng)化，腫瘤周邊可見(jiàn)強(qiáng)化的腫瘤活性組織（圖2）。

圖1 肝動(dòng)脈造影示肝臟腫瘤強(qiáng)化明顯

圖2 聯(lián)合治療后增強(qiáng)CT檢查示腫瘤中心壞死無(wú)強(qiáng)化，腫瘤周邊可見(jiàn)強(qiáng)化的腫瘤活性組織

1.2.5 標(biāo)本處置及觀察項(xiàng)目 每只兔在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)處死后取腫瘤中心組織及消融區(qū)周邊組織行病理學(xué)觀察。切除的標(biāo)本立即在4%甲醛液中固定，經(jīng)沖洗、脫水、透明、切面向下包埋制成蠟塊后切片，HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)和凝固性壞死旁中央?yún)^(qū)的擴(kuò)展情況。

1.2.6 VEGF及MVD表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP法檢測(cè)，VEGF染色陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性。VEGF半定量判定標(biāo)準(zhǔn)參照Inan等[7]的方法，在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)凝固性壞死的周邊區(qū)域，按著色強(qiáng)弱分為4個(gè)等級(jí)，無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，并計(jì)算HSCORE 得分[8][HSCORE=ΣPi（i+1）；i=0，1，2，3；Pi表示評(píng)分為i的比例]。5個(gè)視野的HSCORE積分的平均值作為該張切片的最終積分。MVD陽(yáng)性結(jié)果判定按參考文獻(xiàn)[9]，先在40倍視野中，隨機(jī)選擇5個(gè)新生血管最密集區(qū)，即所謂“熱點(diǎn)”，然后在400倍光鏡視野下記錄微血管數(shù)。每只選取血管密度最大的、不同區(qū)域的5個(gè)視野圖像，取5個(gè)圖像的MVD值的平均數(shù)作為該組的MVD值。任何腫瘤細(xì)胞與鄰近微血管分界清楚并被染成棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)當(dāng)成1個(gè)微血管。同1個(gè)血管的“頭”與“尾”正巧在同一切面上，也作為2個(gè)微血管計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)的方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

TACE和（或）RFA后瘤兔出現(xiàn)精神萎靡、納差、嗜睡等癥狀，一般3 d后恢復(fù)正常；聯(lián)合治療后上述癥狀更明顯，部分瘤兔出現(xiàn)拒食。有5只瘤兔在聯(lián)合治療后24 h內(nèi)死亡，相關(guān)死因可能為T(mén)ACE后再行RFA對(duì)瘤兔創(chuàng)傷過(guò)大、麻醉過(guò)量、出血等。瘤兔死亡后及時(shí)補(bǔ)充。

2.2 殘余腫瘤組織VEGF表達(dá)

VEGF陽(yáng)性信號(hào)定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，瘤灶中陽(yáng)性細(xì)胞多呈簇狀分布或大片狀分布，染色呈棕黃色，在腫瘤組織周邊及腫瘤血管周?chē)黠@密集。對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)VEGF陽(yáng)性表達(dá)較高，呈棕黃至棕褐色（圖3）。聯(lián)合治療后毀損周邊區(qū)域內(nèi)殘余腫瘤內(nèi)VEGF低表達(dá)（圖4）。

2.3 殘余腫瘤組織MVD表達(dá)

所有標(biāo)本中，CD31染色陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞顯示清晰，表現(xiàn)為微血管多有明顯管腔，或僅有不規(guī)則管腔；陽(yáng)性著色點(diǎn)為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，或?yàn)榇貭罘植嫉膬?nèi)皮。瘤灶竇樣血管CD31表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，除門(mén)管區(qū)及中央靜脈外，正常肝組織的肝竇對(duì)CD31基本不表達(dá)，殘余腫瘤的間質(zhì)中表達(dá)較為密集。對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)MVD高表達(dá)，黃染區(qū)為腫瘤微血管（圖5）。聯(lián)合治療后毀損周邊區(qū)域內(nèi)殘余腫瘤內(nèi)MVD 低表達(dá)（圖6）。

2.4 殘余腫瘤組織VEGF及MVD的時(shí)間變化

圖3 對(duì)照組腫瘤非壞死區(qū)內(nèi)VEGF表達(dá)較高（SP×400）

圖4 聯(lián)合治療后毀損周邊區(qū)域內(nèi)殘余腫瘤內(nèi)VEGF低表達(dá)（SP×400）

圖5 對(duì)照組MVD高表達(dá)（SP×400）

圖6 聯(lián)合治療后殘余腫瘤MVD低表達(dá)（SP × 400）

單純RFA組及聯(lián)合治療組VEGF和MVD表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，兩治療組與對(duì)照組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)單純RFA組和聯(lián)合治療組VEGF和MVD表達(dá)兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。殘存腫瘤VEGF與MVD表達(dá)呈正相關(guān)（表2）。

表1 殘存腫瘤VEGF和MVD表達(dá)變化（±s）

表1 殘存腫瘤VEGF和MVD表達(dá)變化（±s）

組別 對(duì)照組 單純RFA組 聯(lián)合治療組 F值 P值VEGF表達(dá)1 d 2.186±0.2971.595±0.1681.651±0.19510.330.0024 d 2.304±0.3371.660±0.1841.695±0.17411.430.0027 d 2.293±0.2691.651±0.2361.725±0.12812.860.001 MVD表達(dá)1 d 24.08±4.4389.88±2.09112.800±3.22224.490.0004 d 25.60±5.54610.76±2.96112.680±2.93520.300.0007 d 25.40±5.37611.76±3.31513.480±2.617617.710.000

表2 殘存腫瘤VEGF與MVD之間相關(guān)性（±s）

表2 殘存腫瘤VEGF與MVD之間相關(guān)性（±s）

組別 動(dòng)物數(shù) VEGF MVD R值 P值對(duì)照組 52.293±0.26925.400±5.3760.9850.002單純RFA組 51.651±0.23611.760±3.3150.9410.017聯(lián)合治療組 51.726±0.12813.480±2.6180.9890.001

3 討論

TACE和RFA都是治療不可切除肝癌的有效方法，但兩者各有其不足之處。肝癌豐富的血供可帶走RFA治療時(shí)的大量熱量，使治療區(qū)域發(fā)生凝固性壞死的時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，加之在三維上仍可能出現(xiàn)治療漏空而致病灶凝固壞死不完全，使治療效果不佳。TACE對(duì)大肝癌有一定的治療作用，但仍為姑息性治療方法，對(duì)絕大多數(shù)腫瘤不能“根治”。若先栓塞肝動(dòng)脈后再行射頻治療則可使肝臟血流量減少而增加RFA的毀損范圍，故RFA與TACE聯(lián)合可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，可發(fā)揮二者的優(yōu)勢(shì)并有協(xié)同放大作用。國(guó)內(nèi)外臨床研究表明，聯(lián)合治療組肝癌結(jié)節(jié)毀損面積較單純RFA組明顯增大，并且長(zhǎng)期效果（復(fù)發(fā)率、生存率）優(yōu)于單純 RFA 組[4，10-11]。

但由于惡性腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)而難以明確其界限、微小腫瘤子灶診斷困難、腫瘤所在的解剖位置、肝腫瘤體積大、形態(tài)不規(guī)則、射頻針工作范圍不夠以及穿刺技術(shù)等因素，聯(lián)合治療后仍存在不同程度的腫瘤殘余，從而成為日后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源，難以達(dá)到“完全治愈”的目的。程洪濤等[12]報(bào)道TACE聯(lián)合RFA治療原發(fā)性肝癌時(shí)，腫瘤直徑30～50 mm者完全消融率為92.6%，50～70 mm者為53.8%，而最大徑超過(guò)70 mm的患者僅為22.2%。因此，研究術(shù)后殘存腫瘤的血管狀況有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作聯(lián)合治療后兔肝VX2殘余瘤模型，動(dòng)態(tài)觀察殘余腫瘤的生物學(xué)活性變化，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

迄今多數(shù)學(xué)者充分肯定了MVD與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后間的密切關(guān)系，認(rèn)為它是反映惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要參數(shù)，VEGF可作為判斷肝癌預(yù)后的重要指標(biāo)。VEGF和MVD可作為判斷原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)VEGF與MVD的表達(dá)情況，定量評(píng)價(jià)殘余腫瘤的血管生成，以觀察兩種治療方法對(duì)殘余腫瘤新生血管的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中VEGF及CD31均高表達(dá)，MVD明顯高于瘤旁組織，提示腫瘤組織有較多的新生血管，在保證腫瘤組織充分的血液供應(yīng)同時(shí)，由于新生血管的血管壁較薄，結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的前提。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)殘留腫瘤組織VEGF、MVD的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純RFA治療后殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達(dá)較對(duì)照組均明顯降低（P＜0.01），并且維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，聯(lián)合治療后殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達(dá)也較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）。盡管聯(lián)合治療組殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達(dá)較單純RFA組絕對(duì)值略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明盡管TACE可能會(huì)引起腫瘤組織VEGF和MVD表達(dá)增加，但RFA治療后仍能有效抑制殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達(dá)，RFA可以通過(guò)有效的破壞腫瘤微血管，控制腫瘤的血管形成，減少腫瘤血液供應(yīng)，有效的滅活腫瘤，減少腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在單純RFA組和聯(lián)合治療組中，隨著VEGF表達(dá)強(qiáng)度降低，腫瘤MVD均相應(yīng)減少，兩者之間存在顯著正相關(guān)，表明VEGF在促進(jìn)新生血管形成中起著重要作用，是促進(jìn)新生血管形成的重要因子。VEGF陽(yáng)性細(xì)胞分布以腫瘤壞死區(qū)域周?chē)?、包膜下區(qū)域及新生瘤巢中較為豐富，與新生血管的分布亦存在較好的一致性。提示VEGF能刺激殘癌細(xì)胞新生血管生長(zhǎng)，并可能在治療后殘癌組織血供重建中起重要作用。盡管聯(lián)合治療能抑制腫瘤血管生成，但殘余腫瘤VEGF和MVD仍存在一定程度的表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用抑制血管生成的藥物可能會(huì)達(dá)到更好的治療效果。

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