李晴媛 徐曉娜

（河南省洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，洛陽(yáng) 471000）

飼料中粗蛋白含量的測(cè)定方法

李晴媛 徐曉娜

（河南省洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，洛陽(yáng) 471000）

粗蛋白含量是飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)的重要控制指標(biāo)。飼料樣品中粗蛋白質(zhì)含量的高低，是評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要因素，決定著配合飼料及飼料原料的成本和價(jià)值。近年來(lái)，我國(guó)飼料工業(yè)發(fā)展迅速，飼料產(chǎn)量也隨之增長(zhǎng)，市場(chǎng)上出售的飼料種類(lèi)繁多，質(zhì)量良莠不齊。國(guó)標(biāo)法測(cè)定飼料中的粗蛋白采用的是凱氏定氮法，由于操作的過(guò)程比較復(fù)雜，如果操作不當(dāng)，往往會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

1 樣品制備

一般的飼料樣品都是經(jīng)過(guò)一定的采集過(guò)程后送檢的。采集方法是否規(guī)范，是粗蛋白測(cè)定準(zhǔn)確與否的基礎(chǔ)。采樣方法隨不同的物品而有所不同，一般來(lái)說(shuō)，可根據(jù)物品均勻性質(zhì)分為下列兩種[1]。

1.1 均勻性質(zhì)物品

對(duì)于均勻性質(zhì)的物品，每一小部分的成分與全部的成分相同，可以采取其任何一部分作為分析樣本。在通常情況下，粉末或研碎后的樣品可用“四分法”來(lái)采樣。

1.2 不均勻性質(zhì)物品

不均勻的物品，須采取多量樣本，然后在取出的樣本中重復(fù)取樣多次，得出一連串逐漸減少的樣本，叫做初級(jí)、次級(jí)、三級(jí)……樣本。分析用的樣本可以在最末一級(jí)樣本中制備，使樣本能代表全部物品。所采用的取樣方法稱(chēng)為“幾何法”。

經(jīng)過(guò)采集的樣品部分基本代表全部樣品的成分，但是，由于飼料在生產(chǎn)過(guò)程中的工藝限制，樣品顆粒并不均勻，所以在實(shí)驗(yàn)前要通過(guò)樣品粉碎來(lái)實(shí)現(xiàn)稱(chēng)量樣品的均勻性。

根據(jù)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定，樣品要求粉碎后全部通過(guò)40目（0.45 mm）分樣篩，然后混合均勻放入密封容器[2]。一般飼料樣品顆粒較大，成分復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)稱(chēng)量樣品量較少，如果細(xì)度不夠，必然造成稱(chēng)樣時(shí)樣品不均勻，這是造成結(jié)果誤差的重要原因。

2 稱(chēng)樣

用分析天平稱(chēng)取試樣0.5～1 g（精確到0.000 1），標(biāo)準(zhǔn)要求做平行樣以保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以需要稱(chēng)樣2份。稱(chēng)樣時(shí)的稱(chēng)樣量要合適，不能太少也不能太多。一般粗蛋白含量在10%以上的飼料稱(chēng)樣量為0.500 0 g即可；若飼料樣品中粗蛋白含量較低，如含量為3%～5%的，稱(chēng)樣量就應(yīng)高于0.5000 g，一般稱(chēng)取1.000 g樣品，否則，測(cè)定結(jié)果的誤差就會(huì)偏大。

3 消化

凱氏測(cè)定法的原理是，飼料樣品在催化劑的作用下，用硫酸消煮分解，使蛋白質(zhì)及其他化合物中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨，硫酸銨在濃堿（一般使用濃度為40%的氫氧化鈉溶液）的作用下放出氨氣，通過(guò)蒸餾，氨氣用過(guò)冷凝管的冷卻回流進(jìn)入吸收瓶中，與吸收液中的硼酸溶液結(jié)合生成四硼酸銨，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，即可測(cè)定出氨氮量，根據(jù)滴定得到的氮含量，乘以換算系數(shù)6.25，計(jì)算出粗蛋白含量[3]。在這個(gè)測(cè)定過(guò)程中，消化過(guò)程是非常重要的環(huán)節(jié)，是決定蛋白質(zhì)測(cè)定成敗的關(guān)鍵。

3.1 硫酸加入量

要根據(jù)樣品的用量來(lái)確定硫酸的用量，一般硫酸應(yīng)加20～30 ml，對(duì)于含鹽量高的樣品，如某些劣質(zhì)魚(yú)粉、肉骨粉之類(lèi)，須相應(yīng)增加硫酸用量，因?yàn)榇嬖?NaCl+H2SO4==2HCl↑+Na2SO4反應(yīng)，會(huì)消耗一部分的硫酸，反應(yīng)產(chǎn)生的HCl加熱后揮發(fā)，對(duì)整個(gè)反應(yīng)無(wú)影響。

3.2 消化溫度與速度

消化時(shí)速度要緩慢，開(kāi)始要用小火，待樣品焦化后，逐步緩慢加強(qiáng)火力。如果升溫過(guò)快，則部分含氮物質(zhì)來(lái)不及轉(zhuǎn)化成硫酸銨而以氣體形式損失掉，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果偏低，此時(shí)最好能在燒瓶口部加上一個(gè)小漏斗，形成回流，延緩蒸發(fā)損失。還要注意的是，在消化過(guò)程中飼料樣品容易飛濺，因此在消化過(guò)程中間，必須將濺到瓶壁上的黑渣搖入瓶底硫酸溶液中，或用少量硫酸沿容器壁沖洗，以避免樣品消化不完全。消化時(shí)要控制好溫度，以380℃時(shí)最宜，最好采用可調(diào)式電爐。

3.3 催化劑的使用

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一般會(huì)在消化液中加入大量硫酸鉀[2]或硫酸銅，其目的是用于提高消化溫度。

消化過(guò)程中，隨著硫酸的分解和水分的蒸發(fā)，硫酸鉀的濃度逐漸增大，消化液沸點(diǎn)升高，加速了有機(jī)物的分解速度。但應(yīng)注意硫酸鉀的用量不能過(guò)大，如果消化溫度太高，生成的硫酸銨也會(huì)分解出氨而使測(cè)定結(jié)果偏低。

在消化液冷卻后呈固態(tài)，則表明硫酸鉀用量過(guò)大，或硫酸用量不足。事實(shí)上，增加試樣量和硫酸量，其混合催化劑的量不必增加。

在試樣消化過(guò)程中，硫酸銅的催化反應(yīng)如下：

除硫酸銅外，常用的催化劑還有汞、氧化汞、硒粉、還原鐵或上述物質(zhì)的混合物。對(duì)于一般谷物樣品，如玉米、小麥、稻谷等的消化，用硫酸銅作催化劑，只要適當(dāng)增加鹽用量，使用強(qiáng)熱源，其效果與汞催化劑完全一樣；對(duì)于難消化物質(zhì)的樣品，硫酸銅催化效果不如汞，測(cè)得蛋白質(zhì)含量偏低。用硫酸銅作催化劑的好處，是在蒸餾氨時(shí)可作為堿性反應(yīng)的指示劑。

添加氧化劑可幫助有機(jī)質(zhì)消化，但氧化性較強(qiáng)的氧化劑會(huì)使氨氧化為氮?dú)鈸p失。對(duì)于富含脂肪或消化過(guò)程中易發(fā)泡的樣品，可在消化前添加少量氧化劑，如過(guò)氧化氫，一般不用高錳酸鉀和次氯酸作氧化劑。

有的飼料檢測(cè)書(shū)上有快速測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，如硒粉催化法、硒粉過(guò)氧化氫催化法、過(guò)氧化氫催化法等，按照這些方法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量常常偏低0.3%～1.0%，如無(wú)特殊情況，特別是測(cè)定的結(jié)果作為飼料配方的數(shù)據(jù)時(shí)，不要用快速測(cè)定法。

3.4 注意事項(xiàng)

消化時(shí)還應(yīng)在凱氏瓶?jī)?nèi)加幾粒玻璃珠，用以防止硫酸漲沸流失；在凱氏燒瓶口蓋一個(gè)小漏斗，使蒸汽凝結(jié)回流，這樣會(huì)使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。當(dāng)消化液達(dá)到透明狀態(tài)時(shí)，并非表示樣品已消化完全，為防止結(jié)果偏低，至少還需加熱消化2 h左右。

4 轉(zhuǎn)移

蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程中的轉(zhuǎn)移過(guò)程也是關(guān)系到測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要步驟，這個(gè)過(guò)程需要注意的問(wèn)題有以下幾點(diǎn)：第一，防止燒傷。由于消化后的樣品溶液中硫酸的含量較高，在燒瓶中加入水后會(huì)產(chǎn)生熱量，容易造成燙傷，不能直接用手去摸燒瓶底部，整個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程都要盡量接觸燒瓶瓶頸上部。第二，防止灑漏。由于燒瓶口無(wú)遮攔，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中容易使溶液損失，增加誤差，這就要求操作過(guò)程謹(jǐn)慎準(zhǔn)確，通過(guò)玻璃棒的引流和漏斗，快、準(zhǔn)、穩(wěn)的進(jìn)行轉(zhuǎn)移。第三，加水和沖洗過(guò)程要掌握少量多次，全部無(wú)損失地轉(zhuǎn)移[4]。

5 蒸餾

氨的蒸餾有兩種方法：常量蒸餾法和半微量蒸餾法。常量法將樣品分解消化后全部用于測(cè)定，取樣量大，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確度都很高。半微量法測(cè)定結(jié)果精密度稍差一點(diǎn)。

蒸餾時(shí)要注意兩點(diǎn)，一是反應(yīng)容器里的溶液總體積要控制，也就是說(shuō)，在沖洗加樣口時(shí)用水要少，否則反應(yīng)室溶液體積太大，液面升高，容易噴進(jìn)冷凝管內(nèi)。二是要控制蒸汽量或火力大小，蒸汽量太大也會(huì)將反應(yīng)液噴進(jìn)冷凝管中；火力太小，蒸餾速度慢，且易發(fā)生倒流；蒸汽產(chǎn)生要均勻，防止暴沸；一定要裝上蒸汽發(fā)生器的安全管，同時(shí)加上幾粒玻璃珠。

6 滴定

滴定用的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度必須準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)溶液在使用前應(yīng)將溶劑瓶上下?lián)u動(dòng)幾次，以便使凝結(jié)到瓶壁上的水珠完全溶入溶液之中，保證溶液濃度均勻一致。滴定時(shí)注意排除滴定管底部的氣泡，確保滴定結(jié)果準(zhǔn)確。

7 空白檢測(cè)

空白測(cè)定是衡量整個(gè)操作過(guò)程中一個(gè)非常重要的綜合性指標(biāo)，良好的空白值是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提，空白值不能超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)范圍。檢測(cè)時(shí)如果發(fā)現(xiàn)空白值過(guò)高，應(yīng)認(rèn)真查找原因并及時(shí)解決?？瞻字党瑯?biāo)一般是由于所用試劑級(jí)別不夠、試驗(yàn)用水不純或玻璃器皿不干凈等原因造成的。

在日常工作中，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，掌握好操作條件，在每一步操作中應(yīng)盡量避免氮的損失，消除由于反應(yīng)不完全對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，取得較為準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

[1] 張靜.淺談怎樣提高飼料中粗蛋白測(cè)定的準(zhǔn)確度[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2009，（1）：9.

[2] 謝飛文.凱氏定氮法測(cè)定飼料粗蛋白的注意細(xì)節(jié)[J].飼料廣角，2003，（14）：17-18.

[3] 韓丹.淺談?dòng)绊戯暳现写值鞍诇y(cè)定準(zhǔn)確度的幾個(gè)因素[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2010，（5）：36-37.

[4] 曹雨莉，李芳林，薛橋.飼料樣品粗蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2007，33（2）：43-44.