郝建新，劉奕煒，楊 洋，賈春鳳，周 方，宋陶然，戎柯曉，張柏林，* ，伏幫炳

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083;2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京100083;3.略陽(yáng)綠洲食品有限公司，陜西略陽(yáng)724300)

杜仲(Eucommiaulmoides)是中國(guó)特有的名貴中藥，但杜仲常以樹皮入藥，故樹木被剝皮后容易死亡，導(dǎo)致資源破壞嚴(yán)重，需要尋求新的資源利用方式與途徑［1］。研究表明，杜仲葉與杜仲皮所含化學(xué)成分，特別是有效成分基本一致［2］，但杜仲葉資源卻未得到有效地開發(fā)和利用。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用［3］。鑒于綠原酸是杜仲葉的有效成分之一，其含量可達(dá)1%～5.5%，常作為判斷杜仲相關(guān)產(chǎn)品的重要指標(biāo)。《中國(guó)藥典2010》版采用綠原酸為對(duì)照物，以綠原酸含量多寡鑒別中藥材料是否為杜仲葉［4］。近年來(lái)，關(guān)于杜仲葉產(chǎn)品開發(fā)有一定的研究［5－9］，但利用綠原酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化杜仲葉發(fā)酵醋的工藝尚未見報(bào)道。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，杜仲葉浸提液經(jīng)酵母、醋酸菌混合發(fā)酵處理，能夠有效保持杜仲液中全部的有效成分［10］。本研究以杜仲葉為原料，以其有效成分之一的綠原酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，輔助與麩皮，開展杜仲葉發(fā)酵醋工藝研究，通過(guò)評(píng)價(jià)杜仲葉發(fā)酵醋的質(zhì)量以及體外抗氧化效果，旨在為綜合利用杜仲資源，開發(fā)新型杜仲醋飲產(chǎn)品提供工藝技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 由陜西省略陽(yáng)縣綠洲食品有限公司提供，經(jīng)自然風(fēng)干及高速粉碎機(jī)粉碎后備用;麩皮 由北京良鄉(xiāng)面粉廠提供;醋前發(fā)酵劑 購(gòu)于上海佳民釀造食品有限公司;醋酸菌AS.14l 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于北京萬(wàn)誠(chéng)博達(dá)科貿(mào)有限公司，為色譜純;纖維素酶、無(wú)水乙醇、乙腈、冰乙酸、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉等 購(gòu)于蘭弋試劑公司。

PHS－3C精密型 pH計(jì) 上海三信儀表廠;MODEL WYT－4型手持糖量?jī)x 福建省泉州光學(xué)儀器廠;LDZX－40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;MGC－250恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SHK－99－Ⅱ臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床 北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司;SHZ－88型往復(fù)式水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;LC－2010AHT高效液相色譜儀 日本島津儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲葉發(fā)酵醋制備

1.2.1.1 杜仲葉預(yù)處理 根據(jù)相關(guān)報(bào)道［11］，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎的杜仲葉，按料液比1∶10混合，纖維素酶添加量為杜仲葉干重的0.8%，酶解溫度45℃進(jìn)行預(yù)處理，最終酶解時(shí)間以釋放出的綠原酸確定。綠原酸含量為592.1μg/mL。

1.2.1.2 酒精發(fā)酵 將預(yù)處理后的酶解液換算成相同重量的杜仲葉干重，并添加與中葉干重相同的麩皮，同時(shí)調(diào)節(jié)杜仲葉－麩皮與水的質(zhì)量體積比為1∶7，按料液體積添加10%的葡萄糖，然后控制料液溫度為121℃殺菌30 min。殺菌結(jié)束后，物料冷卻至室溫，按杜仲－麩皮質(zhì)量接種1%的醋前發(fā)酵劑，30℃下發(fā)酵，至總糖不再變化時(shí)終止酒精發(fā)酵，此時(shí)酒精度達(dá)到9%。

1.2.1.3 醋酸發(fā)酵 含有1%葡萄糖和1%酵母膏的培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20 min，冷卻后加入4%無(wú)水乙醇，然后接入保存在斜面培養(yǎng)基上的醋酸菌AS.14l，37℃振蕩培養(yǎng)3d后備用。將活化后的醋酸菌AS.14l按14%接種量終止酒精發(fā)酵后的杜仲麩皮發(fā)酵液中，37℃振蕩培養(yǎng)3d，然后靜止發(fā)酵2d后終止醋酸發(fā)酵。

1.2.2 優(yōu)化杜仲發(fā)酵醋工藝 基于單因素和正交實(shí)驗(yàn)分析，以綠原酸為檢測(cè)指標(biāo)，研究了料液比、醋前發(fā)酵劑添加量、醋酸菌接種量三個(gè)因素對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋中綠原酸含量的影響。

1.2.2.1 單因素分析 分別考察了料液比，醋前發(fā)酵劑添加量，醋酸菌接種量3個(gè)因素單獨(dú)對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋中的綠原酸含量的影響，并確定各因素較優(yōu)的水平。

1.2.2.2 工藝參數(shù)優(yōu)化 基于單因素影響效果，按表1設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察了料液比、醋前發(fā)酵劑添加量以及醋酸菌接種量3個(gè)因素對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋中綠原酸含量的綜合影響，從而篩選出較優(yōu)的杜仲葉發(fā)酵醋工藝方案(表1)。

表1 基于正交實(shí)驗(yàn)分析建立的杜仲葉發(fā)酵醋優(yōu)化工藝Table 1 The optimization of parameters affecting eucommia－vinegar fermentation according to their interaction analysis by orthogonal test

1.2.3 杜仲葉發(fā)酵醋成品的理化分析(按國(guó)標(biāo)測(cè)定)。

1.2.3.1 總糖測(cè)定 阿貝折光儀法，總糖表達(dá)為%。

1.2.3.2 總酸測(cè)定 中和滴定法，總酸被表達(dá)為g/100mL［12］。

1.2.3.3 衛(wèi)生指標(biāo)檢測(cè) 按照GB 2719－1996食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

1.2.3.4 綠原酸含量測(cè)定 高效液相色譜法［13］。色譜條件:采用迪馬 C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈∶水∶冰醋酸(12∶88∶1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm，柱溫 30℃，流速 1.0mL/min，進(jìn)樣量5μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:即將20mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品用無(wú)水乙醇溶解至5mL，然后依次稀釋到20、40、60、80、100、120、140μg/mL，每次進(jìn)樣量為 5 μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。以綠原酸質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸含量被表達(dá)為μg/mL。

1.2.4 杜仲葉發(fā)酵醋的DPPH自由基清除率測(cè)定［14］

將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、醋酸(作為對(duì)照)以及杜仲葉發(fā)酵醋分別稀釋5，10，15，20，25和30倍后檢測(cè)它們清除DPPH自由基的效果。取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、醋酸以及杜仲葉發(fā)酵醋分別稀釋后的溶液1mL，加入0.004%的DPPH乙醇溶液3mL，室溫靜置30min后517nm處測(cè)定吸光值，以無(wú)水乙醇為空白調(diào)零，陰性對(duì)照不加樣。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算:

式中:Ac:1mL無(wú)水乙醇中添加3mL DPPH·溶液后的吸光度;Ai:1mL待測(cè)液中添加3mL DPPH·溶液后的吸光度;Aj:1mL待測(cè)液中添加3mL無(wú)水乙醇后的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉酶解時(shí)間的確定

2.1.1 酶解液中綠原酸的確定 HPLC圖譜反映了杜仲葉經(jīng)酶解預(yù)處理后檢測(cè)到的綠原酸水平(圖1)。檢測(cè)表明，酶解方式允許杜仲葉中的綠原酸(標(biāo)注峰)大量釋放，綠原酸的保留時(shí)間是12.095min。圖1也說(shuō)明，與文獻(xiàn)中［13］的采取甲醇作為流動(dòng)相相比，采用乙腈作為流動(dòng)相，可以使綠原酸的出峰時(shí)間提前，檢測(cè)效率提高。

圖1 酶解液中綠原酸液相檢測(cè)圖Fig.1 HPLC of chlorogenic acids released from eucommia leaves enzymatically hydrolyzed

2.1.2 酶解時(shí)間的確定 圖2反映了杜仲葉在料液比1∶10、0.8%纖維素酶添加量以及45℃處理下綠原酸釋放量與酶解時(shí)間的關(guān)系。由圖2可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2h后，綠原酸含量基本不隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，此時(shí)綠原酸含量為620.9μg/mL。事實(shí)上，關(guān)于杜仲葉綠原酸酶解時(shí)間的確定，因料液比、酶添加量、酶的種類、pH等處理因素不同會(huì)引起綠原酸釋放時(shí)酶解時(shí)間不同，因而酶解適宜時(shí)間需要通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)條件來(lái)確定［15］。

圖2 酶解液中綠原酸的釋放Fig.2 The level of chlorogenic acids released from hydrolyzed eucommia leaves

2.2 影響杜仲發(fā)酵醋工藝的因素

2.2.1 杜仲葉發(fā)酵醋中綠原酸檢測(cè) 杜仲葉發(fā)酵醋中綠原酸的定性檢測(cè)見圖3。由圖3可以看出，杜仲葉經(jīng)發(fā)酵成為醋飲后，綠原酸(標(biāo)注峰)仍能維持在一定的水平，說(shuō)明酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過(guò)程不會(huì)對(duì)綠原酸含量產(chǎn)生顯著影響，這與相關(guān)報(bào)道相符［10］。其次，與圖1酶解液中綠原酸定性檢測(cè)相比較，綠原酸的出峰時(shí)間基本沒有改變，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程或許不會(huì)影響綠原酸的結(jié)構(gòu)。

圖3 發(fā)酵醋中綠原酸的液相檢測(cè)Fig.3 Chlorogenic acids of fermented eucommia leaves vinegar detected by HPLC

2.2.2 料液比對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋綠原酸含量的影響 將杜仲葉和麩皮的比例、醋前發(fā)酵劑添加量及醋酸菌接種量分別設(shè)為1∶1、10%和10%，對(duì)料液比(杜仲葉－麩皮和水的質(zhì)量比例)影響綠原酸含量的研究表明，在其它因素不變的條件下，隨著料液比增大，綠原酸釋放量有降低的趨勢(shì)，料液比不同，醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)杜仲醋飲中的綠原酸含量不同，料液比越小，杜仲醋飲中綠原酸含量越大。顯然，本研究設(shè)計(jì)的最小料液比不會(huì)影響綠原酸的釋放，在滿足其他條件下，料液比宜取1∶6為好，但是實(shí)際情況料液比為1∶6時(shí)醋的產(chǎn)率太低，綜合考慮料液比宜取1∶7。(圖4)。

圖4 料液比的影響Fig.4 Effect of the solid－liquid ratio on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

2.2.3 醋前發(fā)酵劑添加量對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋綠原酸含量的影響 將杜仲葉和麩皮的比例、料液比和醋酸菌接種量分別設(shè)為1∶1、1∶10和10%，研究了醋前發(fā)酵劑添加量(醋前發(fā)酵劑占杜仲葉－麩皮質(zhì)量的比重)對(duì)綠原酸含量的影響表明，增大醋前發(fā)酵劑添加量，杜仲葉醋飲中的綠原酸含量反而下降，說(shuō)明醋前發(fā)酵劑會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程中綠原酸的釋放，并且在一定醋前發(fā)酵劑添加量范圍內(nèi)抑制作用較為明顯，這種抑制機(jī)理尚不明確，需要進(jìn)一步研究。因此，在酒精度達(dá)到醋酸發(fā)酵前提下，醋前發(fā)酵劑的添加量宜取2%(圖5)。

2.2.4 醋酸菌接種量對(duì)杜仲葉發(fā)酵醋綠原酸含量的影響 將杜仲葉和麩皮的比例、料液比、醋前發(fā)酵劑添加量分別設(shè)為1∶1、1∶10和10%，研究了醋酸菌接種量(液態(tài)菌種占發(fā)酵液體積的比重)對(duì)綠原酸含量的影響表明，隨著醋酸菌接種量的增大，綠原酸含量增加，當(dāng)醋酸菌接種量超過(guò)12%時(shí)，綠原酸含量的增加趨勢(shì)變緩。所以，在一定范圍內(nèi)，增加醋酸菌接種量有助于綠原酸的釋放，本研究取醋酸菌接種量為

12%(圖6)。

圖5 醋前發(fā)酵劑的添加量的影響Fig.5 Effect of the addition of pre－cultures on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

圖6 醋酸菌接種量的影響Fig.6 Effect of the inoculum of strain AS.14l on the release of chlorogenic acids in fermented eucommia leaves vinegar

2.2.5 杜仲葉發(fā)酵醋工藝優(yōu)化參數(shù) 上述單因素分析結(jié)果表明，料液比、醋前發(fā)酵劑添加量以及醋酸菌接種量均會(huì)影響最終杜仲葉發(fā)酵醋飲中的綠原酸釋放水平，顯然，這3個(gè)因素的不同組合水平所釋放出的綠原酸含量是有差異的。為此，我們進(jìn)一步考察了這3個(gè)因素影響杜仲葉發(fā)酵醋飲中綠原酸含量的交互作用，以構(gòu)建優(yōu)化的杜仲葉發(fā)酵醋工藝參數(shù)。基于綠原酸水平，表2是綜合了各因素不同水平的杜仲葉發(fā)酵醋飲篩選工藝方案的結(jié)果。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)中的極差R排序分析，影響杜仲葉發(fā)酵醋中綠原酸含量程度的各因素順序依次為醋前發(fā)酵劑添加量＞料液比＞醋酸菌接種量。結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)中的K值，可以確定各影響因素的最佳組合為A1B1C2，即杜仲麩皮發(fā)酵醋的優(yōu)化工藝條件為物料比1∶7，醋前發(fā)酵劑添加量1%，醋酸菌接種量14%。鑒于優(yōu)化杜仲發(fā)酵醋飲工藝參數(shù)不屬于所設(shè)定的16組實(shí)驗(yàn)內(nèi)，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?；谏鲜龈饕蛩刈罴呀M合條件，獲得杜仲葉發(fā)酵醋中的綠原酸含量為131.1μg/mL，結(jié)合表2數(shù)據(jù)可知，優(yōu)化組合工藝顯著提高了杜仲葉發(fā)酵醋中的綠原酸水平，證實(shí)優(yōu)化工藝參數(shù)可行。

2.3 杜仲葉發(fā)酵醋工藝的建立

本文以綠原酸為目標(biāo)物，基于杜仲葉酶解液中綠原酸釋放條件，結(jié)合杜仲葉發(fā)酵醋飲優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，建立了一種新的杜仲葉發(fā)酵醋飲工藝流程(圖7)。該醋飲工藝包含三個(gè)主要工藝技術(shù):一是杜仲葉酶解處理，二是杜仲葉部分替代麩皮的酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵，由杜仲葉預(yù)處理、酶解、殺菌、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、巴氏殺菌、離心去沉淀和成品8個(gè)步驟完成。在此基礎(chǔ)上，制備出的杜仲葉發(fā)酵醋飲產(chǎn)品中綠原酸含量為131.1μg/mL。

圖7 工藝流程圖Fig.7 Technological flow sheet

表2 優(yōu)化杜仲葉發(fā)酵醋工藝參數(shù)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Parameters for the optimized fermentationof eucommia leaves vinegar according to orthogonal test

2.3.1 杜仲葉發(fā)酵醋成品質(zhì)量分析 按優(yōu)化工藝得到的杜仲葉發(fā)酵醋成品經(jīng)檢測(cè)獲得各項(xiàng)理化指標(biāo)，與國(guó)家釀造食醋(GB18187－2000)標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)結(jié)果列于表3。由表3可以看出，杜仲葉發(fā)酵醋，無(wú)論在感官指標(biāo)，還是理化以及衛(wèi)生指標(biāo)方面，都能很好的滿足國(guó)標(biāo)要求，且成品中的綠原酸含量較高。

2.3.2 杜仲葉發(fā)酵醋的DPPH自由基清除率 鑒于杜仲綠原酸的強(qiáng)烈抗氧化效果，本研究對(duì)基于上述工藝獲得的杜仲葉發(fā)酵醋的體外抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)(圖8)。通過(guò)與相同濃度的綠原酸或者與相同濃度的純醋酸相比，圖8反映了杜仲葉發(fā)酵醋在不同稀釋倍數(shù)下的DPPH自由基清除能力，可以看出，

盡管杜仲葉發(fā)酵醋與綠原酸純品的DPPH自由基清除能力都較強(qiáng)，但隨著稀釋倍數(shù)的上升，與純品綠原酸對(duì)照，杜仲葉發(fā)酵醋的DPPH自由基清除能力隨著稀釋倍數(shù)的增加降低比較慢，稀釋后其自由基的清除效果較綠原酸純品的效果要好。與純醋酸的DPPH自由基清除能力20.98%相比，則在稀釋25倍后，杜仲葉發(fā)酵醋的 DPPH自由基清除能力為69.31%。顯然，杜仲葉發(fā)酵醋有較強(qiáng)的體外抗氧化效果，其中當(dāng)綠原酸與醋酸疊加后大大提高了杜仲葉發(fā)酵醋的體外抗氧化能力。

表3 發(fā)酵醋理化指標(biāo)與國(guó)標(biāo)對(duì)比Table 3 Comparisons of the properties of the fermented eucommia leaves vinegar product with the edible vinegar according to national standard

圖8 DPPH自由基清除率Fig.8 DPPH·scavenging activity

3 結(jié)論

3.1 制備杜仲葉發(fā)酵醋包括三個(gè)環(huán)節(jié)，即杜仲葉酶解預(yù)處理、酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵。酶解時(shí)間是影響杜仲葉中綠原酸釋放的主要因素，而杜仲葉酶解后的料液比、醋前發(fā)酵劑添加量及醋酸菌接種量是最終獲得杜仲葉發(fā)酵醋的關(guān)鍵因素，本研究?jī)?yōu)化了杜仲葉發(fā)酵醋工藝參數(shù)，其中酶解:料液比1∶10、纖維素酶添加量0.8%、溫度45℃、時(shí)間2h;酒精發(fā)酵:杜仲葉－麩皮與水的質(zhì)量體積比為1∶7，葡萄糖添加量為發(fā)酵液體積的10%、醋前發(fā)酵劑添加量為杜仲葉－麩皮質(zhì)量的1%;醋酸發(fā)酵:醋酸菌接種量為發(fā)酵液體積的14%。構(gòu)建了杜仲葉酶解后輔以麩皮發(fā)酵醋的工藝方式，按此工藝制備的杜仲葉發(fā)酵醋產(chǎn)品符合國(guó)標(biāo)要求，且綠原酸含量較高，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化效果。

3.2 本研究證實(shí)，來(lái)自杜仲葉中的綠原酸含量在發(fā)酵醋加工過(guò)程含量變化不大，可以用綠原酸含量作為指標(biāo)篩選杜仲葉發(fā)酵醋的工藝參數(shù)。

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