張淑華，吳志婷，章志玲，潘淑娟，王云霞，劉秋玲，葛郁芝

(江西省人民醫(yī)院、江西省心血管病研究所，南昌 330006)

miRNA有調(diào)控細(xì)胞分化和發(fā)育的作用，在心血管系統(tǒng)的生理病理過(guò)程中起重要作用［1］。研究證實(shí)，miRNA在有疾患的心臟和血管中表達(dá)失控。糾正這些失控miRNA的表達(dá)，對(duì)心肌肥厚、心肌重構(gòu)和心律失常有顯著的逆轉(zhuǎn)效果［2］。miR-1和miR-133是最早確認(rèn)的具有橫紋肌組織表達(dá)特異性的miRNA，二者廣泛參與心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等心臟生理和病理生理過(guò)程，在調(diào)控心臟基因的表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3，4］。因此，miRNA 作為心肌重要的調(diào)節(jié)因子，將成為治療心臟疾病的重要靶點(diǎn)。2011年3～12月，我們觀察了腹主動(dòng)脈部分縮窄大鼠心肌組織miR-350在心肌肥厚形成過(guò)程中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性 SD大鼠20只，體質(zhì)量180～210 g，購(gòu)自江西中醫(yī)學(xué)院。大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞購(gòu)自ATCC。鹽酸氯胺酮(5%)，青霉素(80萬(wàn)U/4 mL)，慶大霉素(8萬(wàn)U/2 mL);培養(yǎng)基、胰酶、抗生素、DMSO等購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自PAA公司;FuGene HD購(gòu)自Roche公司;Trizol購(gòu)自Invitrogen公司;SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作與處理 將大鼠隨機(jī)分成正常組5只、假手術(shù)組5只和模型組10只。分離腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈后，在腎動(dòng)脈分支上方約1 cm處，將7號(hào)注射針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后抽出針頭，造成腹主動(dòng)脈部分縮窄。術(shù)后應(yīng)用超聲診斷儀連續(xù)監(jiān)測(cè)室間隔舒張末期厚度(IVSTd)，左室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)及左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)。7周后處死大鼠，取出心臟并解剖，在預(yù)冷的D-hanks液中漂洗干凈，計(jì)算心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW)、左室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVW/BW)。用Trizol法提取心肌組織RNA，采用芯片技術(shù)檢測(cè)miRNA表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d換成無(wú)雙抗的培養(yǎng)基。用 250 μL Opti-MEM 稀釋 2 μg DNA，250 μL opti-MEM 稀釋5 μL FuGene HD，室溫孵育5 min;將DNA和FuGene HD混合室溫孵育15 min，6孔板換成Opti-MEM培養(yǎng)基，加入孵育好的混合物;轉(zhuǎn)染4～6 h后換成完全培養(yǎng)基。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大作為陽(yáng)性對(duì)照，空質(zhì)粒和未處理的H9c2細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)我們合成了shRNAMAPK14的質(zhì)粒和miR-350的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。

1.2.3 H9c2細(xì)胞直徑檢測(cè) 構(gòu)建表達(dá)該特異性miRNA的質(zhì)粒載體，以Mock為對(duì)照，轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，加入1×10-6mol/L AngⅡ孵育48 h后，用Image J軟件分析檢測(cè)H9c2細(xì)胞直徑。

1.2.4 miR-350及H9c2肥厚相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染96 h后，提取每組細(xì)胞的總RNA，采用miR-350熒光定量PCR試劑盒對(duì)miR-350進(jìn)行定量分析，SYBR GreenⅠ熒光 PCR試劑盒檢測(cè)ANP、BNP、β-myosin 及 α-actin，SYBR GreenⅠ熒光PCR試劑盒進(jìn)行定時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)。Realtime PCR反應(yīng)程序:94℃ 2 min;94℃ 10 s，60℃15 s，72℃ 30 s;40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集設(shè)在72℃(每循環(huán)第3步反應(yīng)時(shí))。熔解度曲線程序設(shè)置為:95℃，2 min;72 ℃，1 min;95 ℃，30 s，步進(jìn)0.5℃/s;30℃，1 min。在運(yùn)行之前，調(diào)節(jié)增益使熒光本底值≤20，也可根據(jù)試劑的實(shí)際情況調(diào)整;儀器檢測(cè)通道選擇設(shè)定為F1(SYBR GreenⅠ)通道。PCR引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0軟件，由上海生工生物工程有限公司合成。引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型超聲及解剖指標(biāo)結(jié)果 造模4周后，模型組IVSTd由(1.63 ±0.21)mm 增至(2.34 ±0.11)mm，造模前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LVPWTd及LVDd無(wú)明顯變化。造模7周后，模型組IVSTd由(2.40 ±0.03)mm 減至(1.87 ±0.21)mm，LVPWTd由(2.52 ±0.24)減至(1.77 ±0.17)mm，LVDd由(6.83±0.28)mm 減至(4.50 ±0.19)mm，造模前后比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或＜0.01)。假手術(shù)組、正常組上述三項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化(P均＞0.05)。解剖發(fā)現(xiàn)模型組心臟大于正常組，質(zhì)量增加，左室增厚顯著，HW/BW和LVW/BW均高于假手術(shù)組和正常組(P均＜0.05)。

2.2 芯片結(jié)果 模型組miR-350表達(dá)比假手術(shù)組上調(diào)6倍(圖1)，其他microRNAs表達(dá)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Real-time PCR法檢測(cè) miR-350表達(dá)發(fā)現(xiàn)miR-350上調(diào)6倍左右，與芯片結(jié)果一致，正常組和對(duì)照組間沒(méi)有表達(dá)差異。

圖1 芯片結(jié)果(箭頭所指代表miR-350)

2.3 過(guò)表達(dá)miR-350后H9c2細(xì)胞變化 見(jiàn)圖2。正常組和陰性對(duì)照組沒(méi)有表達(dá)差異，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大的陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)生明顯肥大。過(guò)表達(dá)miR-350組第1～3天H9c2細(xì)胞未出現(xiàn)明顯變化，第5天時(shí)肥大明顯。轉(zhuǎn)染shRNA-MAPK14質(zhì)粒組的H9c2細(xì)胞肥大，但沒(méi)有miR-350組明顯。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-350后H9c2細(xì)胞變化

2.4 過(guò)表達(dá)miR-350對(duì)H9c2肥厚相關(guān)基因表達(dá)的影響 正常組和陰性對(duì)照組沒(méi)有表達(dá)差異，AngⅡ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大的陽(yáng)性對(duì)照組β-myosin、α-actin、ANP、BNP 基因分別上調(diào) 1.5、2.0、3.0 和 2.2倍;轉(zhuǎn)染 shRNA-MAPK14質(zhì)粒組 β-myosin、α-actin、ANP、BNP 基因分別上調(diào)1.9、2.0、3.0 和 2.2 倍，轉(zhuǎn)染 miR-350 組 β-myosin、α-actin、ANP、BNP 分別上調(diào)2.0、3.0、3.8 和4 倍。見(jiàn)圖3。

圖3 Real-time PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中ANP、BNP、β-myosin及α-actin基因的表達(dá)

3 討論

miR-1和miR-133廣泛參與心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等心臟生理和病理生理過(guò)程。Zhao等［5］報(bào)道，在小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中，miR-1能抑制一類(lèi)堿性螺旋—環(huán)—螺旋類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子Hand2的表達(dá)，促進(jìn)心臟組織分化。Chen等［6］研究小鼠C2C12成肌細(xì)胞分化模型發(fā)現(xiàn)，miR-1能抑制組蛋白去乙酞化酶4表達(dá)，促進(jìn)MEF2的成肌作用;miR-133則通過(guò)抑制miR-1和miR-133同轉(zhuǎn)錄因子SRF的基因表達(dá)，反饋性調(diào)節(jié)miR-1的促肌細(xì)胞分化效應(yīng)。在一些心血管疾病中，許多miRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化，并參與疾病的病理生理過(guò)程。van Rooij等［7］在大鼠胸主動(dòng)脈狹窄心肌肥厚模型發(fā)現(xiàn)一系列表達(dá)上調(diào)的miRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法過(guò)表達(dá)miR-195，足以引起心肌肥厚和心力衰竭發(fā)生。Carè等［8］研究發(fā)現(xiàn)，敲除或下調(diào)miR-133后，能顯著引起心臟肥厚;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-133通過(guò)下調(diào)GDP-GTP、交換蛋白R(shí)hA、細(xì)胞分化周期蛋白42等靶基因的表達(dá)而抑制心肌的生長(zhǎng)和肥大。

miRNA在調(diào)控心臟基因的表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)構(gòu)建心肌肥厚模型，用芯片和Real-time PCR法檢測(cè)miRNA在正常與肥厚的心肌組織間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，在心肌肥厚組織中特異性表達(dá) miRNA，即 miR-350。H9c2細(xì)胞模型證實(shí)，miR-350能引起H9c2細(xì)胞肥大，伴隨心肌肥厚標(biāo)志性基因上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，在心肌肥厚心尖部與正常心肌組織心尖部間存在146個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中2個(gè)在心肌肥厚中表達(dá)上調(diào)1.5倍以上，144個(gè)在心肌肥厚中表達(dá)下調(diào)1.5倍以上。相對(duì)于正常的心肌組織心尖部，心肌肥厚組織中miR-350上調(diào)最明顯，達(dá)6倍以上。miRNA芯片技術(shù)是一種高通量、高靈敏度的檢測(cè)方法，但需用其他方法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)Real-timePCR得到的結(jié)果與芯片結(jié)果完全一致，提示miRNA家族的表達(dá)變化可能與心肌肥厚的發(fā)生有一定聯(lián)系。miR-350能否作為一個(gè)疾病發(fā)生的診斷標(biāo)志有待進(jìn)一步證實(shí)。進(jìn)一步研究miR-350在細(xì)胞水平上的作用，以H9c2細(xì)胞為模型，構(gòu)建miR-350質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中，通過(guò)相差顯微鏡和熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的質(zhì)粒能在H9c2細(xì)胞中表達(dá)。其次，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，H9c2細(xì)胞開(kāi)始變化，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，變大，并伴隨部分細(xì)胞死亡，而對(duì)照組和其他質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組則無(wú)此現(xiàn)象。用Real-time PCR法檢測(cè)心肌肥大的標(biāo)志性基因發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和其他轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組相比，AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，其心肌肥大的標(biāo)志性表達(dá)明顯增多，并用Image J軟件分析得到H9c2細(xì)胞的相關(guān)數(shù)據(jù)，這些實(shí)驗(yàn)都表明，miR-350可引起心肌細(xì)胞肥大。

心肌肥厚是心血管疾病中預(yù)后不良的疾病，能并發(fā)各種引起生命危險(xiǎn)的疾病，如心力衰竭等。miRNA作為誘導(dǎo)心肌肥厚的參與者，有望成為疾病藥物治療的新靶標(biāo)。

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