王東亮，袁 慧，楊立學(xué)*

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

胡桃楸作為我國(guó)東北地區(qū)珍貴的“三大硬闊”樹(shù)種之一，是我國(guó)東北地區(qū)的主要用材樹(shù)種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。造林實(shí)踐表明，胡桃楸純林長(zhǎng)勢(shì)明顯劣于同齡胡桃楸－落葉松（Larix gemelini）混交林［1］。這其中除了混交林對(duì)土壤水分和養(yǎng)分合理、有效利用外［2－5］，胡桃楸純林的自毒作用是一個(gè)不可忽視的原因，很多研究表明胡桃楸是胡桃楸人工純林自毒現(xiàn)象的主要化感物質(zhì)［6－7］，但是仍然有很多胡桃楸根系分泌物的生態(tài)學(xué)作用有待于研究，莽草酸便是其中重要的一種［8］。

1 儀器與試藥

（1）儀器。Agilent1200型高效液相色譜儀、AE240電子天枰、冷凍干燥機(jī)FD－1A－50和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52。

（2）試藥。莽草酸對(duì)照品（上海晶純?cè)噭┯邢薰綡PIC測(cè)定，歸一化法計(jì)算其純度≥98%）。甲醇為色譜純（美國(guó)Dikma公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。胡桃楸土壤樣品分別于2012年5月－9月采集于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山尖砬溝森林培育試驗(yàn)站。

2 色譜條件

流動(dòng)相為甲醇和1%磷酸水溶液（15∶85），流速為1 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為213 nm，柱溫為25℃。在上述條件下，莽草酸與樣品中其他色譜峰基本達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)以莽草酸峰計(jì)算不低于5 000。莽草酸的保留時(shí)間約為2.16 min，如圖1所示。

3 分析方法與結(jié)果

3.1 溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備。精密稱取莽草酸對(duì)照品0.008 g，置于100 mL容量瓶中，加色譜級(jí)甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液（每1 mL含莽草酸80 μg）。

（2）樣品溶液的制備。取凍干的土壤樣品10 g，置于250 mL蒸餾瓶中，量筒量取50 mL乙酸乙酯加入其中，水浴鍋90℃，冷凝回流8 h后，將蒸餾瓶移出水浴鍋，冷卻后將乙酸乙酯轉(zhuǎn)入另一蒸餾瓶，重復(fù)回流3次，將乙酸乙酯混合后，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃濃縮至干，殘余物用5 mL蒸餾水溶解，用2 mol HCl調(diào)節(jié)pH至2.0（以除去懸浮物雜質(zhì)的影響）。125 mL分液漏斗先加入約50 mL乙酸乙酯，將上述樣品溶液倒入分液漏斗，靜置分層后，將乙酸乙酯相分離出來(lái)，濃縮至干，用5mL甲醇溶液溶解，吸出經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后裝入樣品瓶，得胡桃楸樣品溶液。

圖1 莽草酸對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatogram of shikimic reference substance

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取莽草酸對(duì)照品貯備液1、2、4、6、8、10、12和14 mL，分別置于25 mL容量瓶中并定容，濃度分別為 3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、32.0、38.4和44.8 μg/mL（峰面積分別為107.4、 216.3、 440.9、 676.2、 886.1、1 105.8、1 338.9 和 1 561.5），搖 勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾并分別裝入進(jìn)樣瓶中備用。分別精密吸取10 uL注入色譜儀，得進(jìn)樣量X（μg）與峰面積Y的線性方程。結(jié)果表明，莽草酸進(jìn)樣量在3.2～44.8 μg/mL之間與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=34.788X－3.038 1，r=0.999 8（n=6）。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取莽草酸對(duì)照品溶液（32.0 μg/mL）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得色譜峰峰面積平均值為1 106.4，RSD為0.25%，顯示重復(fù)性良好，符合分析要求。

3.4 精密度試驗(yàn)

精密稱取胡桃楸根際土樣品6份，按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得莽草酸含量的平均值為10.806 μg/g，RSD為3.33%，顯示精密度良好，符合分析要求。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 胡桃楸根際土中莽草酸含量 （n=6）Tab.1 The content of shikimic acid in manchurian walnut rhizosphere soils

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取胡桃楸根際土樣品溶液，在色譜條件下，于0、4、8、12和24 h分別測(cè)定莽草酸峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為1.45%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)（加樣回收試驗(yàn)）

精密稱取已知含量的胡桃楸根際土樣品約10g，共6份，分別精密加入一定量的莽草酸對(duì)照品，按樣品溶液制備及測(cè)定法操作，分別進(jìn)行色譜分析，其平均回收率為97.85%，RSD為0.69%，符合分析要求。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.7 樣品測(cè)定

精密吸取胡桃楸根際土和非根際土樣品溶液和莽草酸對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定色譜峰峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of recovery experiments

表3 不同時(shí)期胡桃楸土壤中莽草酸的含量Tab.3 The content of shikimic acid in manchurian walnut soils in different periods

4 討論

（1）樣品溶液的制備方法的選擇。試驗(yàn)中分別考察了超聲提取和加熱冷凝回流方法的提取效果，以加熱冷凝回流法提取效率最高。在加熱冷凝回流法中，又分別比較了不同的加熱時(shí)間（12 h和24 h）、不同的重復(fù)回流次數(shù)（4 h/次，6 h/次，8 h/次，12 h/次）、不同體積倍數(shù)甲醇（80%和100%）溶解效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，加熱24 h、重復(fù)回流3次（8 h/次），并最終用色譜級(jí)甲醇溶解，可將莽草酸從土壤中基本提取。

（2）流動(dòng)相的選擇。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸、甲醇－磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)［9－13］，從分離情況和出峰時(shí)間等綜合分析選擇甲醇與1%磷酸水溶液等度洗脫為佳，并且保留值適宜，柱后處理簡(jiǎn)單、方便。

（3）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取一定量的莽草酸對(duì)照品，用流動(dòng)相稀釋，放置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在190～400 nm范圍內(nèi)掃描［13］，結(jié)果顯示其最大吸收波長(zhǎng)為215 nm，在相同色譜條件下對(duì)210、213、215、218和220 nm幾個(gè)波長(zhǎng)處進(jìn)行考察，結(jié)果表明，在213 nm處基線平穩(wěn)，并且峰形良好，故選擇213 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5 結(jié)束語(yǔ)

采用HPLC法測(cè)定胡桃楸土壤中的莽草酸的含量，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化對(duì)比后認(rèn)為采用甲醇和1%磷酸（15∶85）體系檢測(cè)莽草酸，待測(cè)組分與其它組分有效分離，且保留值適宜，柱后處理簡(jiǎn)便、省時(shí)。方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度和回收率都能滿足胡桃楸土壤中的莽草酸定性和定量分析的要求。結(jié)果表明，胡桃楸土壤中根際土莽草酸含量大于非根際土中的含量，并且隨著時(shí)間的推移莽草酸的含量出現(xiàn)先增長(zhǎng)，后降低的變化。

】

［1］韓嘉勇，張惠林，許忠海，等.胡桃楸優(yōu)質(zhì)用材林經(jīng)營(yíng)技術(shù)［J］.林業(yè)科技，2002，27（2）:3 －15.

［2］陳喜全，史鳳友，陳乃全，等.胡桃楸落葉松人工混交林營(yíng)養(yǎng)元素含量的季節(jié)動(dòng)態(tài)［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（水胡黃椴專刊），1991，19:221 －227.

［3］邢存旺，陳俊歧.落葉松胡桃楸人工混交林下土壤團(tuán)聚程度和水分能量特征分析［J］.河北林業(yè)科技，1995（2）:24－27.

［4］陳永亮，李淑蘭.胡桃楸、落葉松純林及其混交林下葉凋落物分解與養(yǎng)分歸還的比較研究［J］.林業(yè)科技，2004，29（5）:9 －12.

［5］陳永亮.韓士杰.周玉梅.等.胡桃楸、落葉松純林及其混交林根際土壤有效磷特性的研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（7）:790－794.

［6］Thomson R H.Naturally Occurring Quinones［M］.London:Academic Press，1971.

［7］Rietveld W J.Allelopathic effects of juglone on germination and growth of several herbaceous and woody species［J］.Journal of Chemical and Ecology，1983，9:295 －308.

［8］楊立學(xué).落葉松對(duì)胡桃楸化感作用的研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2006.

［9］汪 紅，邊清泉.雪松葉中莽草酸的RP－HPLC測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（11）:797 －799.

［10］馬廉舉，劉 新.反相離子對(duì)色譜法測(cè)定馬尾松松針中莽草酸的含量［J］.中藥材，2008，31（1）:63 －65.

［11］謝濟(jì)運(yùn)，陳小鵬，粟本超，等.高效液相色譜法測(cè)定松針中莽草酸的含量［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2010，22（7）:943 －947.

［12］夏從龍，周 濃，劉光明，等.云南松中莽草酸含量的高效液相色譜法測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）:1607 －1608.

［13］張志琴，劉光明，楊永壽，等.云南松松針中莽草酸的含量測(cè)定［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2102，21（1）:10 －12.