張紅云，燕善軍，徐瑞芳

上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院感染科，上海 201199

腹水是機(jī)體系統(tǒng)性或局部性疾病在腹膜腔局部免疫反應(yīng)的表現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)檢查是對(duì)腹水性質(zhì)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性最多只有60%。傳統(tǒng)檢測手段由于敏感性、特異性、操作復(fù)雜程度等原因，目前的檢測方法仍不能滿足臨床需要［1］，尤其是良惡性腹水之間的鑒別頗為困難。早期研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群在腹水免疫應(yīng)答中具有重要意義［2］，我們采用流式細(xì)胞儀檢測良惡性腹水中CD8+CD28－T細(xì)胞表達(dá)水平，以探求其在良惡性腹水鑒別診斷中的意義和價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 72例腹水標(biāo)本均選自上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科、感染內(nèi)科、腫瘤內(nèi)科2011年10月－2012年8月住院患者。其中結(jié)核性腹水20例，男12 例，女8 例，平均年齡(49.08 ±11.82)歲，有結(jié)核病史伴臨床癥狀，結(jié)核菌素試驗(yàn)強(qiáng)陽性，腹水中找到結(jié)核桿菌、ADA活性明顯升高，抗結(jié)核治療2周有效。通過B超、CT等各項(xiàng)檢查排除腹腔腫瘤。肝硬化性腹水24例，男 13例，女 11例，平均年齡(51.78±10.96)歲，臨床乙肝肝硬化診斷明確，腹水常規(guī)檢測為漏出液，除外伴發(fā)感染、原發(fā)性肝癌等其他并發(fā)癥腹水。惡性腹水28例包括卵巢癌8例，胃癌9例，肝癌11例，均經(jīng)腹水細(xì)胞學(xué)檢查確診，CT、B超、病理等檢查發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤原發(fā)灶，男 13例，女 15例，平均年齡(54.31±10.47)歲。

1.2 檢測方法 無菌抽取腹水10 ml置入已經(jīng)去酶處理并加入肝素鈉抗凝劑(15 ul/ml)的無菌管，路途上保存腹水于冰盒中，并于1 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞分離調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。用可調(diào)移液器將 CD8-FITC、CD28-PerCP、CD45-PerCP(美國 BD PharMingen公司)加入試管，避光在4℃冰箱中孵育30 min。加入PBS緩沖液2 ml，4℃下以2000 r/min的相對(duì)離心力離心5 min，并去上清液。重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國 BD PharMingen公司)檢測。采用Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞，以前向角FSC和側(cè)向角SSC散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD8、CD28散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分T細(xì)胞(CD8+CD28－)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，通過WinMDI軟件分析得到陽性細(xì)胞的百分比。計(jì)量資料采用表示，采用方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)等處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組腹水中CD8+CD28－T細(xì)胞檢測結(jié)果呈正態(tài)分布數(shù)值，予求均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差:惡性腹水組淋巴細(xì)胞中CD8+CD28－T細(xì)胞的平均表達(dá)水平為(24.75±4.09)%明顯高于結(jié)核性腹水組(13.83±2.38)%及肝硬化性腹水組(16.15±1.49)%，予三組腹水兩兩比較，結(jié)果顯示:惡性腹水組與肝硬化性腹水組及結(jié)核性腹水組差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0167)，而肝硬化性腹水組與結(jié)核性腹水組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.0167)(見表1，圖1～3)。

表1 三組腹水CD8+CD28－T細(xì)胞表達(dá)水平兩兩比較Tab 1 The comparison of CD8+CD28－Ts in the three groups

圖1 惡性腹水CD8+CD28－T細(xì)胞流式分析;圖2 肝硬化性腹水患者CD8+CD28－T細(xì)胞流式圖;圖3 結(jié)核性腹水患者CD8+CD28－T細(xì)胞流式圖Fig 1 The expression of CD8+CD28－Ts in malignant ascites;Fig 2 The expression of CD8+CD28－Ts in liver cirrhosis ascites;Fig 3 The expression of CD8+CD28－Ts in tuberculous cirrhosis ascites

3 討論

腹腔積液是機(jī)體系統(tǒng)性或局部性疾病在腹膜腔局部免疫反應(yīng)的表現(xiàn)，隨積液的積累，大量免疫細(xì)胞被募集，對(duì)疾病的病理進(jìn)程產(chǎn)生影響［3］。腫瘤是引起腹水重要因素，有時(shí)甚至是首發(fā)癥狀。由于細(xì)胞免疫是機(jī)體清除胞內(nèi)感染菌和癌變細(xì)胞的主要途徑，因此，腹腔局部微環(huán)境中免疫應(yīng)答狀態(tài)對(duì)疾病發(fā)生、轉(zhuǎn)歸起重要作用。腹水中免疫細(xì)胞以T淋巴細(xì)胞為主，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在人體抗腫瘤免疫中居主導(dǎo)地位，其關(guān)鍵是激活腫瘤細(xì)胞抗原特異性殺傷性T細(xì)胞殺瘤活性。CD8+CD28－T細(xì)胞具有識(shí)別抗原的特異性，能直接對(duì)病毒和病毒感染的細(xì)胞發(fā)揮作用。其相關(guān)因子在腹水的生成和發(fā)展中可能起一定的作用［4］。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，CD8+CD28－T細(xì)胞在惡性腫瘤組織、外周血、腫瘤引流淋巴結(jié)及腹水中的表達(dá)情況，相對(duì)于健康成人、非腫瘤性病變周圍淋巴結(jié)及正常組織，其CD8+CD28－T細(xì)胞表達(dá)水平增高非常顯著，同時(shí)具有抑制T、B細(xì)胞活性和介導(dǎo)細(xì)胞毒活性兩大功能［5］。Curiel等［6］發(fā)現(xiàn)，在腫瘤晚期階段，體內(nèi)的CD8+CD28－T細(xì)胞主要積聚于腫瘤部位和腹水中，很少停留于腫瘤引流淋巴結(jié)。

本研究結(jié)果顯示惡性腹水組CD8+CD28－T細(xì)胞表達(dá)水平明顯高于良性腹水組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可能與惡性腹水微環(huán)境分泌某些因子，如 IL-2、TGF-β1、VEGF、COX-2，直接或間接地(如通過抗原提呈細(xì)胞)誘導(dǎo)CD8+CD28－T細(xì)胞的特定擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化有關(guān)。同時(shí)外周血、胸腺、骨髓及淋巴結(jié)等組織器官中天然存在的CD8+CD28－T細(xì)胞在荷瘤宿主體內(nèi)不同成熟階段的抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)趨化下向腹水微環(huán)境募集和擴(kuò)增［7］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在針對(duì)特異性抗原的克隆刪除或由Fas介導(dǎo)的凋亡中，CD8+CD28+T細(xì)胞和CD8+CD28－T細(xì)胞在敏感性上存在差異，腫瘤分泌的因子可能會(huì)選擇性地誘導(dǎo)CD8+CD28+T細(xì)胞凋亡［8］。由此推測腹水中CD8+CD28－T細(xì)胞的檢測有助于發(fā)現(xiàn)早期惡性腹水病變，其在腹水中的顯著表達(dá)可能系惡性腹水患者伴有多種免疫功能的損害，并隨著腫瘤的發(fā)展而加重。

綜上所述，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測腹水中 CD8+CD28－T細(xì)胞表達(dá)水平避免了細(xì)胞學(xué)檢查時(shí)反復(fù)穿刺收集腹水給患者帶來的痛苦和并發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)惡性腹水患者的早期診斷、干預(yù)治療、病情監(jiān)測具有重要的臨床意義。

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