黃紹芳，吳 飛，朱難蘭，賀永文

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430022

核內(nèi)HMGBl的主要生物學(xué)功能是與DNA結(jié)合，參與DNA的重組、修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞復(fù)制及分化成熟等生命活動(dòng)。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)它可以釋放到胞外參與膿毒癥的發(fā)病過程，為一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，隨后HMGBl作為促炎細(xì)胞因子引起廣泛研究。目前已發(fā)現(xiàn)HMGBl的重要受體包括晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll樣受體 2(toll like receptor2，TLR2)、TLR4［1］。但究竟是哪個(gè)受體起主要作用，尚不明確，本實(shí)驗(yàn)腹腔注射HMGB1至普通小鼠和TLR4基因敲除小鼠，以D-氨基半乳糖胺(D-Galn)和脂多糖(LPS)制備急性肝衰竭模型小鼠作為對(duì)照，研究其生物活性，探討其致炎作用過程中的作用通路。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 普通小鼠:72只SPF級(jí)C57BL普通小鼠(體質(zhì)量20 ～25 g)，等滲鹽水溶解 D-Galn、LPS、HMGB1(購自sigma公司)。禁食12 h，隨機(jī)分為3組，每組24只，以下藥物均腹腔注射，對(duì)照組:D-Galn 600 mg/kg、LPS 5 μg/kg;實(shí)驗(yàn)組:HMGB1150 μg/kg;空白組:等量生理鹽水。分別于2、6、12、24 h經(jīng)眼眶取血，末次取血后頸椎脫臼處死，取中央肝組織固定12 h，制成石蠟切片HE染色。

1.1.2 TLR4基因敲除小鼠:5對(duì)雌雄TLR4基因敲除小鼠(C57BL/10ScNJ購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)于SPF級(jí)條件下繁殖出72只(體質(zhì)量20～25 g)，按1.1.1方法分組、注射藥物及取肝組織和血清。

1.1.3 肝組織HMGB1指標(biāo)檢測:按免疫組化三步法標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，顯微鏡下照相，mage-Pro Plus 6.0軟件半定量HMGB1在單位面積的IOD值，即一個(gè)視野中陽性范圍IOD值之和除以該視野肝組織總面積。

1.1.4 肝組織 HMGB1-mRNA檢測:SYBR?Green I嵌合熒光法進(jìn)行RT-PCR檢測HMGB1-mRNA相對(duì)含量，分別從小鼠肝組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以:5'-TGGGCAAAGGAGATCCTAAA-3'、5'-GCAG ACATGGTCTTCCACCT-3'為引物，β-acting為內(nèi)參，按照SYBR?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司)說明書在 StepOnePlusTMReal-Time PCR System 進(jìn)行，用2－▽▽Ct法計(jì)算HMGB1-mRNA和相對(duì)含量。

1.1.5 血清中 ALT、HMGB1測定:按 ELISA試劑盒(購自深圳欣博盛公司)標(biāo)準(zhǔn)方法操作。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)變化

2.1.1 普通小鼠:對(duì)照組(D-Galn和 LPS)和實(shí)驗(yàn)組(HMGB1)均于2 h開始出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，大部分細(xì)胞水腫氣球樣變，6 h小片狀壞死，至24 h，絕大部分肝組織壞死，小葉結(jié)構(gòu)消失，肝竇充血，炎性細(xì)胞浸潤(見圖1A～1B)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組病理學(xué)改變基本相似?？瞻捉M全程正常肝組織。

2.1.2 TLR4基因敲除小鼠:對(duì)照組和空白組一樣，全程均正常，實(shí)驗(yàn)組2 h出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，部分細(xì)胞水腫，6 h少部分區(qū)域融合成片狀壞死。至24 h，仍可見少部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也出現(xiàn)大片壞死，肝竇出血，炎性細(xì)胞浸潤，與普通小鼠實(shí)驗(yàn)組相比，肝損傷程度稍輕，(見圖1C～1D)。

2.2 免疫組化HMGB1結(jié)果

2.2.1 普通小鼠:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均于2 h部分肝細(xì)胞內(nèi)見點(diǎn)狀褐色小顆粒。6 h褐色呈小片狀分布。12 h有一半以上區(qū)域見大片黃染區(qū)。24 h黃染幾乎滿布視野(見圖2A～2B)?？瞻捉M2～24 h除核內(nèi)少量表達(dá)外無表達(dá)。單位面積 IOD值:對(duì)照組2、6、12、24 h IOD 值(5.29 ±1.03、8.59 ±1.17、28.24 ±3.41、89.70±7.05)與實(shí)驗(yàn)組(4.91 ±0.98、9.01 ±1.64、30.77 ±4.79、93.35 ±10.33)全程較空白組均出現(xiàn)明顯的表達(dá)增多，且隨時(shí)間延長而增加。

2.2.2 TLR4基因敲除小鼠:對(duì)照組2～24 h除核內(nèi)少量表達(dá)外無明顯表達(dá)，與空白組相似(見圖2C);實(shí)驗(yàn)組2 h少數(shù)細(xì)胞內(nèi)見褐色小顆粒。6 h褐色于匯管區(qū)小片狀分布。12 h有將近一半?yún)^(qū)域見大片黃染區(qū)。24h黃染大部分視野可見(見圖2D)。單位面積IOD值:2、6、12、24 h IOD 值對(duì)照組分別為:1.33 ± 0.21、1.52 ±0.16、1.22 ±0.09、1.76 ± 0.35，與空白組一樣處于極低水平，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;實(shí)驗(yàn)組分別為 2.87 ±0.52、5.91 ±0.83、31.77 ±4.18、75.11 ±8.48，在整體趨勢上略低于普通小鼠實(shí)驗(yàn)組兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組24 h肝組織切片(HE 200×)A:普通小鼠對(duì)照組;B普通小鼠實(shí)驗(yàn)組;C:TLR4基因敲除小鼠對(duì)照組;D:TLR4基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組; 圖224 h肝臟組織切片組化檢測HMGB1(HE 200×)A:普通小鼠對(duì)照組;B普通小鼠實(shí)驗(yàn)組;C:TLR4基因敲除小鼠對(duì)照組;D:TLR4基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組Fig 1 Liver biopsy stained with HE at 24 hours(HE 200×) A:The normal mice control group;B:The normal mice exprimental group;C:TLR4 knock-out mice control group;D:TLR4 knock-out mice exprimental;Fig 2 Expression of HMGB1 in liver tissues was detected with immunohistochemisty at 24 hours(HE 200×)A:The normal mice control group;B:The normal mice exprimental group;C:TLR4 knock-out mice control group;D:TLR4 knock-out mice exprimental

2.3 肝組織HMGB1-mRNA結(jié)果 由圖4所示，相對(duì)于空白組倍數(shù)定量，在普通小鼠中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均隨時(shí)間延長而明顯升高，對(duì)照組峰值24 h(182.09±20.39)倍和實(shí)驗(yàn)組峰值12 h(200.54 ±24.57)倍;在TLR4基因敲除小鼠中，對(duì)照組與空白相差不大，均無明顯表達(dá);實(shí)驗(yàn)組也明顯隨時(shí)間延長升高［12 h峰值為(155.69±17.18倍)］，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于普通小鼠的實(shí)驗(yàn)組［12 h峰值(200.54±24.57)倍］兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 RT-PCR檢測HMGB1-mRNAFig 3 HMGB1-mRNA was detected by RT-PCR

3 血清中ALT和HMGB1水平

3.1 血清中 ALT 普通小鼠對(duì)照組12 h峰值為(144.27 ±20.37)U/L、普通小鼠實(shí)驗(yàn)組 12 h 峰值為(127.42±11.05)U/L和TLR4基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組12 h峰值(157.36±23.79)U/L均明顯升高，表明這3組出現(xiàn)嚴(yán)重肝功損傷，遠(yuǎn)高于空白組(9.19±3.57)U/L;普通小鼠空白組、TLR4基因敲除小鼠對(duì)照組和空白組各時(shí)間點(diǎn)均處于低水平，三組之間，相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖4)。兩種小鼠在對(duì)照組腹腔注射:D-Galn 600 mg/kg、LPS 5 μg/kg;實(shí)驗(yàn)組:rHMGB1150 μg/kg。

圖4 血清ALT含量Fig 4 Serum level of ALT

3.2 血清內(nèi)HMGB1 普通小鼠對(duì)照組24 h峰值為(189.91 ±21.31)ng/ml、普通小鼠實(shí)驗(yàn)組為(234.25±17.03)ng/ml和 TLR4基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)組(194.63 ±12.74 ng/ml)均明顯升高，遠(yuǎn)高于空白組(1.99±0.85)ng/ml;普通小鼠空白組、TLR4 基因敲除小鼠對(duì)照組和空白組各時(shí)間點(diǎn)均處于低水平，三組之間相互比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見圖5)。

圖5 血清HMGB1含量Fig 5 Serum level of HMGB1

4 討論

人類HMGB1的氨基酸序列中含有215個(gè)氨基酸殘基，生理狀態(tài)下存在于細(xì)胞核中，有3個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成，分別為A-box(氨基酸1～79)、B-box(氨基酸89～163)、C-tail。HMGBl釋放至胞外后，B-box是引起炎性反應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域，而A-box對(duì)B-box有拮抗作用［2］。HMGB1由活的炎癥細(xì)胞主動(dòng)分泌或由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放到核外。HMGBl是一種很強(qiáng)的晚期炎性因子，在肝衰竭的肝臟組大量增多并進(jìn)入血液［3］，通過RAGE、TLR2和TLR4受體途徑，可以激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并激活NF-KB。NF-KB是多種“損傷反應(yīng)基因”的多效轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的激活可引起靶細(xì)胞產(chǎn)生多種損傷因子如炎癥前細(xì)胞因子白介素-6、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1 等，產(chǎn)生致病效應(yīng)［1，4］。

普通小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:腹腔注射D-Galn和LPS的對(duì)照組和腹腔注射HMGB1的實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)嚴(yán)重的肝組織壞死，免疫組化和RT-PCR可知肝組織內(nèi)均有HMGB1的大量表達(dá)，血清內(nèi)HMGB1也均明顯升高;血清內(nèi)ALT均明顯升高說明HMGB1和LPS一樣，也可以導(dǎo)致普通小鼠肝臟嚴(yán)重的損傷。

TLR4基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:腹腔注射DGaln和LPS的對(duì)照組與注射鹽水的空白組一樣，肝組織完全正常，組化切片和RT-PCR可知肝組織內(nèi)僅細(xì)胞核內(nèi)少量表達(dá)HMGB1，細(xì)胞漿無HMGB1表達(dá)，血清內(nèi)ALT和HMGB1也無升高，說明LPS不能導(dǎo)致TLR4基因敲除小鼠的肝損傷，提示LPS主要通過TLR4受體發(fā)揮肝損傷作用;注射HMGB1的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)嚴(yán)重的肝組織壞死，組化切片和RT-PCR可知肝組織內(nèi)均有HMGB1的大量表達(dá)，血清內(nèi)HMGB1對(duì)照組和ALT對(duì)照組較空白組均明顯升高，但較普通小鼠實(shí)驗(yàn)組肝損稍輕，可知TLR4受體的敲除，對(duì)于HMGB1的致炎作用影響并不大，因此HMGB1同樣能導(dǎo)致TLR4基因敲除小鼠嚴(yán)重的肝損傷，推測HMGB1的致炎作用通路可能主要為RAGE。后續(xù)將進(jìn)行RAGE基因敲除小鼠的相關(guān)實(shí)驗(yàn)是我們的下一步研究目標(biāo)，以進(jìn)一步明確HMGB1的作用機(jī)制。

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