劉建芝 趙玉武 褚秀麗 徐周偉

低血糖是一種十分常見的臨床現(xiàn)象，尤其在糖尿病患者的治療過程中經(jīng)常發(fā)生。低血糖產(chǎn)生的危害較高血糖更迅速、更嚴(yán)重，輕者導(dǎo)致易激惹、局灶性神經(jīng)功能損害、昏迷等，重者可導(dǎo)致死亡［1－2］。一旦發(fā)生低血糖，目前的治療原則強(qiáng)調(diào)立刻給予高濃度葡萄糖，迅速將血糖升高并維持在8.3～11.1 mmol／L［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，低血糖后血糖升高過快會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞增加，并提出了低血糖后“葡萄糖再灌注”的概念［4］，但其機(jī)制尚不清楚。本研究進(jìn)一步了觀察低血糖后升高血糖速度對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞壞死及其超微結(jié)構(gòu)改變的影響，同時(shí)探討了不同升高血糖水平下活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量280～320g，購自上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)時(shí)晝夜各12h。采用簡單隨機(jī)抽樣方法將大鼠分為模型組（24只）、空白對照組（6只）、假手術(shù)組（6只）。模型組再按照血糖升高水平分為1～3mmol／L、3～6mmol／L、6～9mmol／L、＞9mmol／L亞組，各亞組大鼠6只。

1.2 方法

1.2.1 低血糖再灌注模型的制作：參照Sang Won Suh等［5］造模方法并稍作調(diào)整。大鼠術(shù)前禁食12h，用1%（質(zhì)量濃度）戊巴比妥鈉按體質(zhì)量0.5mL／100g腹腔注射麻醉，通過股靜脈置入密閉式靜脈留置針。用微量注射泵靜脈推注短效胰島素諾和靈R（1U／mL）誘導(dǎo)低血糖。用血糖儀（Roche，德國）通過尾靜脈半小時(shí)測一次血糖。血糖開始降至1mmol／L以下時(shí)停止胰島素推注，此時(shí)大鼠腦電圖處于等電位狀態(tài)。維持1h后，用25%（質(zhì)量濃度）葡萄糖溶液通過股靜脈推注升高血糖，升糖速度分別為0.75、1.5、2.0和3.5mL／h，使大鼠血糖在1h后分別升高到1mmol／L＜血糖≤3mmol／L（1～3mmol／L組）、3mmol／L＜血糖≤6mmol／L（3～6mmol／L組）、6mmol／L＜血糖≤9mmol／L（6～9mmol／L 組）和血糖＞9 mmol／L（＞9mmol／L組）4個(gè)不同的濃度水平，并維持3h，使血糖保持穩(wěn)定?？瞻讓φ战M為不作任何處理的正常大鼠，假手術(shù)組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后通過股靜脈置入密閉式靜脈留置針，通過股靜脈按體質(zhì)量15U／kg推注含胰島素的葡萄糖（1.5mL／h），使血糖水平維持在（5.50±0.25）mmol／L的正常范圍內(nèi)，維持5h。在低血糖造模過程中，排除發(fā)生四肢抽搐、癲癇發(fā)作、死亡的大鼠。本實(shí)驗(yàn)共選取130只大鼠，其中96只（73.8%）造模成功。

1.2.2 神經(jīng)細(xì)胞壞死情況觀察：于造模術(shù)后7d經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦。經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后用石蠟切片機(jī)（Leica RM2235）切取4 um厚冠狀切片，每個(gè)標(biāo)本在前囟后2.8～3.3 mm間隔80μm取5張切片。采用HE染色后觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞壞死情況，壞死的細(xì)胞核濃縮、深染，胞漿呈嗜伊紅染色。采用雙盲法于光鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)腦片兩側(cè)海馬CA1區(qū)、齒狀回（DG）區(qū)和顳葉皮層（2～3層）細(xì)胞壞死總數(shù)，并計(jì)算均值。

1.2.3 透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)：于術(shù)后7d經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取一側(cè)海馬，在DG區(qū)切取1mm3組織塊，以4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛固定24 h，磷酸漂洗液漂洗3次；以1%（質(zhì)量濃度）鋨酸固定3h，磷酸漂洗液漂洗3次。然后脫水、包埋、固化、超薄切片機(jī)切片60nm、染色，置透射電鏡（Hitachi-7650，日本）下觀察海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 ROS檢測：超氧化物陰離子熒光探針（dihydroethidium，DHE）可自由進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶。氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光［6］。DHE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，用1%（質(zhì)量濃度）二甲亞砜稀釋至1mg／mL，在大鼠血糖開始降至1mmol／L以下時(shí)按體質(zhì)量1mg／kg經(jīng)股靜脈給藥。葡萄糖再灌注結(jié)束后立即處死，經(jīng)心灌注固定后取腦，梯度脫水，用冰凍切片機(jī)（Leica CM 1850）切取20μm厚切片，置熒光顯微鏡510～500nm處測量各組大鼠CA1、DG和顳葉皮層的Et熒光密度。Et信號強(qiáng)度用神經(jīng)元核周和背景的平均熒光比率表示?？瞻讓φ战M未進(jìn)行ROS檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用 SNK（Student-Newman-Keuls）檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦神經(jīng)元壞死比較 各組大鼠海馬CA1、DG和顳葉皮層細(xì)胞壞死數(shù)間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。與空白對照組比較，假手術(shù)組、1～3mmol／L組海馬CA1、DG及顳葉皮層細(xì)胞壞死數(shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；3～6 mmol／L組、6～9mmol／L組、＞9mmol／L組海馬CA1、DG區(qū)及顳葉皮層細(xì)胞壞死數(shù)均較假手術(shù)明顯增加（均P＜0.01）；3～6mmol／L組和6～9 mmol／L組間比較各區(qū)細(xì)胞壞死數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；與＞9mmol／L組比較，1～3 mmol／L組、3～6mmol／L組和6～9mmol／L組大鼠各區(qū)細(xì)胞壞死數(shù)均顯著減少（均P＜0.01，圖1、表1）。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)及顳葉皮層神經(jīng)元死亡（箭頭所示）情況比較（HE，×400）

表1 各組大鼠海馬和顳葉皮層壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠海馬和顳葉皮層壞死神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與＞9mmol／L組比較，＃P＜0.01

組別 例數(shù) CA1區(qū) DG區(qū)6 19.68± 3.58 36.68± 7.15 46.40± 7.99假手術(shù)組 6 20.65± 4.05 49.19±12.69 50.00± 7.35 1～3mmol／L組 6 21.88± 4.05＃ 47.56± 6.82＃ 58.20± 9.31＃3～6mmol／L組 6 55.48±16.22＊＊＃ 82.96±18.8＊＃ 98.80±14.49＊＊＃6～9mmol／L組 6 49.84± 5.86＊＊＃ 100.28±20.64＊＊＃ 107.20± 9.09＊＊＃＞9mmol／L組 6 134.73±30.02＊＊ 801.44±66.55＊＊ 153.60±18.65＊＊F值顳葉皮層空白對照組0.01 47.06 135.7 53.41 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜

圖2 透射電鏡下觀察低血糖再灌注后大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化（×12000）

圖3 低血糖再灌注后不同組別CA1區(qū)、DG區(qū)和顳葉皮層ROS檢測

2.2 大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜完整，核染色質(zhì)均勻，核仁清晰，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，髓鞘完整（圖2A）；1～3 mmol／L組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜完整，核仁清晰，髓鞘結(jié)構(gòu)完整，線粒體輕度腫脹（圖2B）；3～6 mmol／L組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜基本完整，線粒體嵴排列基本正常，部分線粒體發(fā)生腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，髓鞘有溶解現(xiàn)象（圖2C）；6～9mmol／L組海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜基本完整，可見異染色質(zhì)，線粒體腫脹，線粒體嵴破裂；髓鞘溶解（圖2D）；＞9 mmol／L組組大鼠海馬神經(jīng)元核膜模糊，胞漿溶解壞死，線粒體明顯腫脹呈空泡狀，線粒體基質(zhì)顆粒消失，線粒體嵴普遍破裂、溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張（圖2E）。和假手術(shù)組相比，不同升糖速度組均有不同程度的線粒體損傷和髓鞘變化，其中＞9 mmol／L組最嚴(yán)重。

2.3 ROS檢測 各組大鼠海馬CA1和DG區(qū)熒光信號比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，不同升糖水平組海馬CA1區(qū)和DG區(qū)熒光信號均明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；與1～3mmol／L組比較，另3個(gè)升糖水平組海馬CA1區(qū)和DG區(qū)熒光信號均升高（P＜0.05），而3～6 mmol／L組和6～9mmol／L組相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖3，表2）。

3 討論

低血糖是用藥物治療糖尿病患者時(shí)常見的一種嚴(yán)重并發(fā)癥［6］。與缺血性腦損傷不同，低血糖性腦損傷主要集中在海馬CA1區(qū)、DG區(qū)和顳葉皮層［7］。

神經(jīng)元受損傷時(shí)，其超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一系列變化：核染色質(zhì)邊集并出現(xiàn)異染色質(zhì)、核膜溶解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫脹、髓鞘溶解等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低血糖后迅速升高血糖（＞9mmol／L組）較緩慢升高血糖（1～3mmol／L組）更易造成神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷，且神經(jīng)元的壞死程度較緩慢升高血糖（1～3mmol／L組）顯著。氧化應(yīng)激造成ROS過量產(chǎn)生是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的主要因素。Sang Won Suh等證實(shí)低血糖造成神經(jīng)元死亡不是在低血糖階段產(chǎn)生而主要是由葡萄糖再灌注觸發(fā)，ROS是在葡萄糖再灌注階段產(chǎn)生［5］。本研究結(jié)果顯示快速升高血糖（＞9mmol／L組）時(shí)ROS產(chǎn)生的程度比緩慢升高血糖（1～3mmol／L組）顯著。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)ROS檢測比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)ROS檢測比較（±s，n＝6）

注：與假手術(shù)組相比，＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；與1～3 mmol／L組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 CA1區(qū) DG區(qū)假手術(shù)組0.81±0.33 0.49±0.12 1～3mmol／L組 1.57±0.21＊＊ 1.16±0.49＊3～6mmol／L組 2.37±0.59＊＊＃ 1.98±0.53＊＊＃6～9mmol／L組 3.67±1.07＊＊＃＃ 2.43±0.60＊＊＃＃＞9mmol／L組 5.16±0.39＊＊＃＃ 3.58±0.51＊＊＃＃F值0.01 33.33 24.26 P值 ＜0.01 ＜

目前公認(rèn)的低血糖誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡的信號途徑是一個(gè)多步驟的級聯(lián)反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)中的關(guān)鍵步驟包括：谷氨酸受體激活［8］、葡萄糖再灌注、ROS產(chǎn)生［9］、鋅離子釋放［10］、線粒體通透性改變［11］和聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1活化［12］。最新研究發(fā)現(xiàn)，低血糖可以造成腦組織中興奮性氨基酸水平的改變［13］，興奮性氨基酸如谷氨酸過度活化在低血糖性腦損傷中發(fā)揮重要作用［14］，谷氨酰胺可以在葡萄糖被剝奪的過程中保護(hù)小腦顆粒神經(jīng)元線粒體膜電位的穩(wěn)定［15］。目前臨床中對于低血糖的治療是即刻給予50%葡萄糖，使血糖迅速升高到8.3～11.0mmol／L。本研究電鏡和 HE染色結(jié)果均顯示，過快的升高血糖反而會(huì)加重腦損傷，這和臨床中的治療原則相矛盾，對于臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。雖然目前關(guān)于低血糖再灌注的研究取得了明顯的進(jìn)展，但其中某些機(jī)制仍然不清楚，如在嚴(yán)重低血糖階段細(xì)胞外液谷氨酸濃度升高的原因等尚有待進(jìn)一步研究。

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