熊 柳 南 沖 孫慶杰 李凡飛

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109)

新制作面包、饅頭、蛋糕等面制品都具有內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)松軟、有彈性、口感良好的特點(diǎn);但隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，就會(huì)由軟變硬，組織變得松散、粗糙、彈性和風(fēng)味也隨之消失，降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)，這就是食品的回生(老化)現(xiàn)象［1］。這些面制品的回生主要是由于其中所含的淀粉回生引起的。淀粉的回生包括直鏈分子螺旋結(jié)構(gòu)的形成及其堆積、支鏈淀粉外支鏈間雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成與雙螺旋之間的有序堆積［2］。直鏈淀粉分子長(zhǎng)短及直、支鏈的比例與回生速率呈高度相關(guān)，可由消除或抑制支鏈淀粉分子結(jié)晶的形成來(lái)抑制淀粉質(zhì)食品的回生［3］。目前，抑制淀粉回生的主要方法有基因修飾、酶法修飾、化學(xué)修飾、物理修飾［4］。但是基因修飾的方法抑制淀粉回生，所要求的技術(shù)和成本都很高，化學(xué)修飾易產(chǎn)生毒性和帶來(lái)食品安全問(wèn)題，物理修飾中的添加食品添加劑如海藻糖、親水性膠體、乳化劑、多糖類、低聚糖、食用膠類和變性淀粉等，盡管這些添加劑對(duì)淀粉的回生有一定的抑制作用，但效果遠(yuǎn)達(dá)不到人們所希望的效果;因此，這些方法在食品工業(yè)的應(yīng)用大大受的限制。酶法修飾是指用酶水解淀粉物質(zhì)，但保持或至少保持淀粉顆粒結(jié)構(gòu)或分子的層次結(jié)構(gòu)。有研究指出生物酶法是一種很好的抑制淀粉回生的方法，通過(guò)在饅頭、面包和米粉等的制作過(guò)程中添加淀粉酶，可有效延長(zhǎng)米面制品的保鮮時(shí)間，是一種較具有前途的方法［5］。

Hardeep SG［6］研究認(rèn)為在面包貯藏后期，支鏈淀粉的凝沉作用是影響面包老化的主要因素。α－淀粉酶能使支鏈淀粉在糊化時(shí)側(cè)鏈變短，從而降低支鏈淀粉分枝部分相互合并重結(jié)晶的機(jī)會(huì)，從而延緩面包老化。木伍六司［7］通過(guò)研究α－，β－和葡萄糖淀粉酶對(duì)米飯硬化回生的影響后認(rèn)為:β－淀粉酶可以顯著抑制米飯的回生硬化。丁文平等［8］在普魯蘭酶和β－淀粉酶對(duì)大米支鏈淀粉回生影響的研究中指出，β－淀粉酶能夠通過(guò)切短大米支鏈淀粉外側(cè)枝健而抑制其回生，且隨著酶解度的增加回生抑制更加明顯。孫慶杰等［9］通過(guò)β－淀粉酶對(duì)米粉進(jìn)行抗回生處理后，生產(chǎn)的保鮮米制品1年內(nèi)不回生。以上研究主要說(shuō)明了淀粉酶對(duì)于淀粉回生具有抑制作用，酶抑制淀粉回生的機(jī)理及酶處理后淀粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化未作深入研究。孫玲玲等［10］對(duì)β－淀粉酶抑制糯米支鏈淀粉回生工藝通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化，得出β－淀粉酶抑制糯米支鏈淀粉回生時(shí)最佳工藝條件為:酶濃度0.111%，溫度59.8℃，時(shí)間41.4 min。但國(guó)內(nèi)并未有對(duì)β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生工藝優(yōu)化的研究。

因此，本研究在前人研究基礎(chǔ)上，以小麥淀粉為原料，采用β－淀粉酶對(duì)其進(jìn)行抗回生處理。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化β－淀粉酶抗小麥回生工藝條件;并通過(guò)測(cè)定在最佳工藝條件下處理后的小麥淀粉中還原糖和直鏈淀粉含量及支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度，初步探討β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生的機(jī)理，為今后β－淀粉酶抑制淀粉質(zhì)食品回生的工業(yè)化提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

直鏈淀粉標(biāo)樣、支鏈淀粉標(biāo)樣、β－淀粉酶(酶活力1 771.2 U/g):美國(guó)Sigma公司;右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品:瑞典Pharmacia公司;二甲基亞砜、氯化鈣、鹽酸、3，5－二硝基水楊酸、丁醇、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、異戊醇、碘、碘化鉀均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

101－1型恒溫干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;冰箱:中國(guó)海爾集團(tuán)公司;紅外水分測(cè)定儀:北京賽多利斯有限公司;HH－S恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療器械廠;755B型紫外可見(jiàn)分光光度儀:上海精密科學(xué)儀器有限公司;LD5－2A型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;質(zhì)構(gòu)測(cè)定儀(TA－XT.plus):英國(guó) Stable Micro Systems公司;GPC－RI－DAWN EOS十八角度激光散射聯(lián)用系統(tǒng):美國(guó)懷雅特公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥淀粉的制備及脫脂

小麥淀粉的制備:以山東萊州市聯(lián)合面粉廠提供的小麥粉為材料，根據(jù)梁玲等［11］提供的小麥淀粉的方法，實(shí)驗(yàn)室自制。根據(jù)國(guó)標(biāo)提供的方法測(cè)得自制的小麥淀粉中含蛋白質(zhì)0.28%、脂肪0.12%、無(wú)機(jī)鹽 0.32%、水分 12.8%。

小麥淀粉的脫脂［12］:稱取淀粉20 g溶于400 mL DMSO水溶液中，在90℃加熱30 min，再加入2倍量95%乙醇使淀粉分子沉淀，收集沉淀，并在碾缽中碾成粉末，轉(zhuǎn)移到布氏漏斗中，以無(wú)水乙醇洗滌，最后在CaCl2真空干燥器中干燥至恒重。

1.3.2 β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生的處理工藝

稱取一定量的小麥淀粉，加小麥淀粉質(zhì)量1.2倍的水(pH保持不變)，攪拌均勻，沸水蒸汽中糊化3 min，冷卻到40～50℃后，添加一定量的β－淀粉酶液(以添加同樣量的蒸餾水作對(duì)照)，揉勻于一定溫度下恒溫放置一定時(shí)間，之后再沸水蒸汽中蒸3 min滅酶，冷卻，做成質(zhì)量相同、厚度均勻、表面平整的淀粉凝膠樣品。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝

結(jié)合前人對(duì)酶抑制淀粉回生因素的研究及大量的預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定了酶作用時(shí)間(X1)、酶作用溫度(X2)及酶濃度(X3)3個(gè)對(duì)β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生效果影響顯著的因素作為試驗(yàn)因素，淀粉凝膠硬度(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定試驗(yàn)因素范圍，分析設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平編碼見(jiàn)表1，數(shù)據(jù)采用SAS RSREG統(tǒng)計(jì)軟件分析。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.3.4 小麥淀粉凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

將經(jīng)酶處理后小麥淀粉凝膠放于冰箱中，4℃保溫48 h之后，采用TA.XT plus物性儀對(duì)制得的β－淀粉酶處理后小麥淀粉凝膠質(zhì)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，主要參數(shù)為:運(yùn)行模式:Texture Profile Analysis(TPA);試驗(yàn)前速:1.00 mm/s;試驗(yàn)速度:1.00 mm/s;返回速度:1.00 mm/s;測(cè)試距離:30.00%;感應(yīng)力:Auto－10.0 g;兩次壓縮時(shí)間間隔 5 s;數(shù)據(jù)采集速率:200 point/s;探頭:P35，探頭高度為30 mm。測(cè)試完畢后利用質(zhì)構(gòu)儀分析軟件得到硬度。以上試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3.5 直鏈淀粉與還原糖含量的測(cè)定

淀粉凝膠樣品，用無(wú)水乙醇脫水后，50℃烘干，粉碎，過(guò)100目篩。直鏈淀粉含量的測(cè)定采用碘比色法［13］，于620 nm處測(cè)得吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣中直鏈淀粉含量。還原糖含量的測(cè)定采用3，5－二硝基水楊酸比色法［14］，還原糖含量的計(jì)算公式:還原糖=(還原糖質(zhì)量×樣品的稀釋倍數(shù))/樣品總質(zhì)量×100%。

1.3.6 酶處理前后小麥淀粉中支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度的測(cè)定

將酶處理前后的淀粉樣品用正丁醇－異戊醇法［15］分離純化直鏈淀粉和支鏈淀粉。取酶處理前后支鏈淀粉6 mg于50 mL離心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L pH 5.0的乙酸鈉緩沖液，95℃加熱溶解30 min，冷卻至室溫，加入3 mL普魯蘭酶溶液(0.1 mol/L pH 5.0的醋酸鈉緩沖液，700 IU)，混合均勻后在40℃水浴中震蕩(150 r/min)水解24～30 h，然后再沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心。

采用蒽酮－硫酸法［16］測(cè)定總糖，得一個(gè)數(shù)據(jù)Gr(以葡萄糖的量表示);采用Somogyi法［17］測(cè)定還原末端的數(shù)量，得到一個(gè)數(shù)據(jù)GR(以葡萄糖的量表示)。按下式計(jì)算平均聚合度:

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)工藝條件進(jìn)一步研究，以獲得最佳工藝參數(shù)。采用Design Expert統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型模型，并對(duì)擬合方程作方差分析，P ＜0.05為顯著，P ＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box－Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各個(gè)因素的選取范圍區(qū)間，以響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次試驗(yàn)小麥淀粉凝膠的硬度(Y)的平均值為響應(yīng)值，對(duì)顯著影響酶抑制小麥淀粉回生效果的酶作用溫度(X1)、酶作用時(shí)間(X2)和酶濃度(X3)3因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。1～12號(hào)為析因試驗(yàn)，13～17號(hào)為5個(gè)中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

應(yīng)用Design Expert軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型模型如下:

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

由表3方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，該模型回歸顯著(P ＜0.000 1)。R2該模型的 R2=0.992 6，說(shuō)明此模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)失擬項(xiàng)小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)影響β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生效果的3因素主次順序依次是酶作用溫度、酶作用時(shí)間、酶濃度。回歸方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明:一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素，因此各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定處理的最佳條件。

2.1.2 響應(yīng)面分析

利用Design－Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖1所示，在酶用量一定時(shí)，小麥淀粉凝膠硬度受酶作用溫度與酶作用時(shí)間交互影響顯著。凝膠硬度隨酶作用溫度的升高，呈先降低后增大的趨勢(shì)。這是由于在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度的升高，酶活增加，抑制小麥淀粉凝膠的回生效果增強(qiáng)，當(dāng)溫度超過(guò)一定值時(shí)，酶活降低或部分失活，故影響了酶對(duì)小麥淀粉凝膠回生的抑制效果。因此選擇酶作用溫度在56.5℃左右。在酶作用溫度一定時(shí)，淀粉凝膠硬度受酶濃度與酶作用時(shí)間交互影響顯著。隨酶濃度和酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉凝膠硬度降低。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，酶對(duì)淀粉凝膠回生的抑制效果趨于完全，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，抑制回生效果變化不明顯。在酶作用時(shí)間一定時(shí)，淀粉凝膠硬度受酶濃度與酶作用溫度交互影響顯著。隨酶濃度的增大，淀粉凝膠硬度呈顯著性降低，在濃度就一步增大時(shí)，硬度降低趨于平緩。這是由于隨酶濃度的增大，酶解度逐漸增大達(dá)最大，之后趨于平緩。

由圖1可知，酶作用溫度對(duì)酶抑制小麥淀粉凝膠回生的效果最好，表現(xiàn)為曲線較陡。其次是酶作用時(shí)間和酶用量，表現(xiàn)為曲線較為平緩。經(jīng)軟件分析，優(yōu)化的酶抑制小麥淀粉凝膠工藝條件為:酶作用溫度56.5 ℃，酶作用時(shí)間32.3 min，酶濃度為34.33 U。

圖1 因素相互作用對(duì)淀粉凝膠硬度的影響

2.1.3 β－淀粉酶抑制淀粉凝膠回生工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)二次回歸的數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果，最佳工藝條件:酶濃度34.33 U，酶作用溫度為56.50℃，酶作用時(shí)間32.20 min。預(yù)測(cè)在此條件下的小麥淀粉凝膠硬度為5 302 g。為了證實(shí)預(yù)測(cè)的結(jié)果，用試驗(yàn)中得到的最佳工藝條件，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，得在4℃的冰箱中保溫48 h后小麥淀粉凝膠硬度值為度為(5 342±7.82)g。與在此工藝條件下預(yù)測(cè)小麥淀粉中硬度值的相對(duì)誤差僅0.75%。

未經(jīng)酶處理的小麥淀粉凝膠硬度為(15 780.14±8.32)g，經(jīng)β－淀粉酶處理后，小麥淀粉凝膠硬度降低了66.15%，β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生效果顯著。因此，該試驗(yàn)所得的數(shù)學(xué)模型和最佳工藝參數(shù)對(duì)于工業(yè)化應(yīng)用β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生具有更為準(zhǔn)確的指導(dǎo)性，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，延長(zhǎng)淀粉質(zhì)食品的貨架期。

2.2 酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉及還原糖含量

采用本試驗(yàn)中優(yōu)化后的β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝，經(jīng)碘比色法測(cè)得的酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉含量和采用3，5－二硝基水楊酸比色法測(cè)得的還原糖含量見(jiàn)表4。

表4 酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉和還原糖含量/g/100 g

從表4可以看出，酶處理后小麥淀粉中還原糖含量顯著性升高，由酶處理前的0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g。而直鏈淀粉含量顯著性降低，由酶處理前的25.40 g/100 g，減少到21.80 g/100 g。其原因可能是β－淀粉酶從直鏈淀粉的非還原性末端以麥芽糖為單位被分解，造成生成麥芽糖的含量迅速升高。直鏈淀粉由于被部分水解，使得分子長(zhǎng)度減小，與碘反應(yīng)的顏色變淡，使側(cè)得的直鏈淀粉含量降低。

大米淀粉的回生主要是由支鏈淀粉的重結(jié)晶引起，直鏈淀粉的含量與支鏈淀粉重結(jié)晶成核速率有顯著正相關(guān)，但與支鏈淀粉最終重結(jié)晶程度沒(méi)有顯著相關(guān);因此，可以推斷直鏈淀粉通過(guò)參與支鏈淀粉晶核的形成來(lái)影響支鏈淀粉的重結(jié)晶過(guò)程，但不參與支鏈淀粉后期晶體的生長(zhǎng)和穩(wěn)定［12，18］。Gidley［19］研究認(rèn)為直鏈淀粉分子間通過(guò)氫鍵形成雙螺旋，在直鏈淀粉雙螺旋富集區(qū)中氫鍵堆積形成結(jié)晶。Yu等［20］在研究中發(fā)現(xiàn)淀粉的回生焓隨直鏈淀粉的含量增加而升高，回生焓值越高回生速率越快。

CGBiliaderis［7］以DSC法系統(tǒng)研究了各種糖類(多羥基化合物)對(duì)蠟性玉米淀粉結(jié)晶度的影響，研究指出，麥芽糖能有效的抑制淀粉的回生。本試驗(yàn)中，由于β－淀粉酶的對(duì)小麥淀粉的水解作用，縮短直鏈淀粉及支鏈淀粉直線分支的長(zhǎng)度，減少其重結(jié)晶趨勢(shì)，有效的抑制了淀粉的回生，且在同時(shí)產(chǎn)生的小分子糖亦有可能起到了抑制淀粉回生的作用。

2.3 小麥淀粉中支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度

測(cè)得的酶處理前后小麥淀粉中支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度見(jiàn)表5。

表5 酶處理前后支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度

由表5可知，小麥淀粉經(jīng)β－淀粉酶處理后，支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度降低，支鏈淀粉側(cè)鏈聚合度顯著降低。Fredriksson等［21］在對(duì)直鏈淀粉與支鏈淀粉特性對(duì)淀粉回生影響的研究指出，淀粉的長(zhǎng)期回生主要是由支鏈淀粉外側(cè)短鏈的重結(jié)晶所引起，該過(guò)程是一個(gè)緩慢長(zhǎng)期的過(guò)程。支鏈淀粉的結(jié)晶主要是通過(guò)支鏈淀粉外層短鏈以雙螺旋為基質(zhì)，通過(guò)氫鍵堆積而成。姚遠(yuǎn)［12］通過(guò)高效排阻色譜證實(shí)β－淀粉酶的處理可以使部分支鏈淀粉外側(cè)短鏈聚合度降低2～3個(gè)葡萄糖單位。部分支鏈淀粉外側(cè)短鏈聚合度降低，淀粉分子的成核和結(jié)晶速度降低，回生受到抑制。同時(shí)，有研究指出，β－淀粉酶可以抑制淀粉回生，主要是其能縮短支鏈淀粉的外鏈長(zhǎng)度。因此，支鏈的長(zhǎng)短與分布對(duì)支鏈淀粉的重結(jié)晶有重要影響［22］。與前人相關(guān)研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)中結(jié)果顯示，酶處理后樣品中支鏈淀粉平均側(cè)鏈分子長(zhǎng)度降低，抑制了小麥淀粉的回生，從而使得酶處理后小麥淀粉凝膠硬度相比未經(jīng)酶處理的小麥淀粉凝膠硬度顯著降低。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法對(duì)β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生工藝進(jìn)行了優(yōu)化。建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型為以后的中試以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，并且得到了酶處理的最佳工藝條件為:酶濃度34.33 U，酶作用溫度為56.5℃，酶作用時(shí)間32.2 min，在此條件下測(cè)得小麥淀粉凝膠硬度相對(duì)于未經(jīng)酶處理的小麥淀粉凝膠硬度降低了66.15%。測(cè)定酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉和還原糖含量以及支鏈淀粉平均側(cè)鏈長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)β－淀粉酶處理后小麥淀粉中直鏈淀粉含量顯著性降低，由酶處理前的25.40 g/100 g，減少到21.80 g/100 g;還原糖含量顯著性升高，由酶處理前的 0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g，直鏈淀粉和支鏈淀粉分子質(zhì)量和分子長(zhǎng)度顯著降低，支鏈淀粉側(cè)鏈長(zhǎng)度降低。因此，得出β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生的主要原因是β－淀粉酶作用小麥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉，以麥芽糖為單位水解直鏈淀粉和支鏈淀粉，從而降低了淀粉分子鏈長(zhǎng)，降低了其形成雙螺旋的趨向，抑制了淀粉的回生。酶作用過(guò)程中產(chǎn)生的麥芽糖也可能對(duì)于小麥淀粉凝膠回生亦可能起到了一定的作用。

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