江均平 李春紅 張 濤 云冬梅 楊雪豐

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，北京 100193)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所2，北京 100081)

(北京農(nóng)學(xué)院3，北京 102206)

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一類物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在體內(nèi)能與相應(yīng)的胰蛋白酶形成一定的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)。

現(xiàn)代研究表明，TI對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎［1］、輻射損傷［2－3］、HIV 和腫瘤［4－6］等有一定的療效;農(nóng)業(yè)上，TI可以用于病蟲害防治;食品工業(yè)，TI可以用來(lái)抑制蛋白酶，防止香腸、肉丸、低鹽魚產(chǎn)品、海洋藍(lán)鲹魚糜凝膠軟化［7－8］，改善肉類食品的質(zhì)構(gòu)。但是，TI是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，可降低蛋白質(zhì)的消化利用，造成胰腺分泌失調(diào)性肥大和增生［9］，引起體內(nèi)含硫氨基酸的內(nèi)源性散失致使體內(nèi)氨基酸代謝失調(diào)或不平衡。因此，如何科學(xué)食用紅小豆使之最大發(fā)揮保健效果又不抗?fàn)I養(yǎng)也是需要解決的問(wèn)題。

紅小豆(Vigna angularis)原產(chǎn)于中國(guó)，已有2000多年的栽培史，印度、緬甸、朝鮮、日本等國(guó)均有栽培，在膳食結(jié)構(gòu)中占有十分重要的地位。臨床證實(shí)紅小豆粉外敷治療病毒性腮腺炎和化膿性腦膜炎并硬腦膜下積液有特效［10－11］，雖然其治療機(jī)理尚不清楚，但與紅小豆中含有大量的胰蛋白酶抑制劑可能有關(guān)。紅小豆每克含(458.55±5.90)UTI，經(jīng)90 ℃處理60 min活性未見(jiàn)重要變化，在pH 4～10室溫放置30 min未見(jiàn)失活，在 pH 2～3下降約5%［12］，可以作為蛋白酶抑制劑用于食品加工防止凝膠軟化，因此紅小豆是生產(chǎn)TI的潛在資源。但由于所研究的紅小豆種質(zhì)數(shù)量少，尚難全面體現(xiàn)不同種質(zhì)胰蛋白酶抑制劑的含量及特性。本研究收集了一定數(shù)量的紅小豆品種，測(cè)定了其TI含量，并對(duì)3種高產(chǎn)品種TI的種類及穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以便為我國(guó)紅小豆資源的開(kāi)發(fā)利用以及科學(xué)食用紅小豆提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

18份紅小豆品種種子來(lái)自我國(guó)主產(chǎn)區(qū)(2010年產(chǎn));苯甲酰－DL－精氨酸－對(duì)硝基酰胺鹽(BAPNA):Sigma公司;胰蛋白酶(1∶250)(Trypsin＞250 N.F.U/mg):Bio Basic Inc.公司。

1.2 儀器設(shè)備

TP－114電子分析天平:美國(guó)丹佛公司;UV－752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海元析儀器有限公司;1093 CYCLOTEC旋風(fēng)磨:瑞典Foss公司;DYY－8C電泳儀:北京六一儀器公司。

1.3 TI的提取

將豆混勻，取約50 g紅小豆用旋風(fēng)磨磨成80目，裝于塑料袋，置于冰箱備用。取(1 000.0±1.0)mg紅小豆粉用20 mL蒸餾水于150 mL三角瓶中，180 r/min振蕩提取1 h(37℃)，12 000 r/min離心10 min得TI提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制劑活力測(cè)定

參照 AACC，1999［13］、燕方龍等［14］的方法進(jìn)行。于試管中依次加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－HCl緩沖液、0.2 mL TI溶液、0.2 mL 0.8 mg/mL 胰蛋白酶溶液(40 mg胰蛋白酶用2 mL 1 mmol/L鹽酸溶解，蒸餾水定容至50 mL)，37℃保溫5 min后，加入 0.5 mL 0.4 mg/mL BAPNA 溶液(20.0 mg BAPNA用0.5 mL二甲基亞砜溶解，用20 mmol/L CaCl2－0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－ HCl緩沖溶液定容至50 mL，臨用前配制)，保溫10 min后加入0.2 mL 30%乙酸，混勻，以空白對(duì)照(反應(yīng)時(shí)最后加酶液)作參比，測(cè)定410 nm的吸光度。抑制率控制在40%～60%。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)2個(gè)平行反應(yīng)管，以3個(gè)重復(fù)的平均測(cè)定結(jié)果±標(biāo)準(zhǔn)差表示樣品中TI的含量。

抑制劑活性單位定義:在上述反應(yīng)條件下抑制1 mg 1∶250的胰蛋白酶活性所需要的抑制劑量為1單位(TIU)。

1.5 高溫對(duì)抑制劑穩(wěn)定性的影響

取0.5 mL提取液于離心管中，加入0.5 mL蒸餾水，100℃水浴30 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行電泳及測(cè)定殘余活性。

1.6 酸性條件對(duì)抑制劑穩(wěn)定性的影響

吸取0.5 mL上清液于離心管中，再加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 1.5 的 KCl－ HCl緩沖液，37 ℃靜置8 h，然后進(jìn)行電泳及測(cè)定殘余活性。

1.7 TI多型性電泳分析

參照黃國(guó)偉等［15］、Felicioli等［16］的方法進(jìn)行。取(1 000.0±1.0)mg豆粉用50 mL蒸餾水于150 mL三角瓶中180 r/min振蕩提取1 h(37℃)，12 000 r/min離心10 min得TI提取液，用蒸餾水稀釋5倍，與等體積電泳樣品緩沖液混合，取20 μL進(jìn)行明膠－PAGE。采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng)，濃縮膠濃度5%，分離膠12%，2種膠均含0.2%明膠，電極緩沖液為pH 8.3 Tris－甘氨酸，濃縮膠電壓80 V，分離膠150 V，電泳畢，用100 mL 胰蛋白酶(25 μg/mL，用脫酶液配制)酶解 20 min(搖床轉(zhuǎn)速 50 r/min、37℃)，然后將酶液倒干盡使凝膠緊貼培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿37℃酶解60～90 min，然后用150 mL脫酶液(0.05 mol/L、pH 7.5 Tris － HCl－0.2 mol/L NaCl－0.01 mol/L CaCl2)分3次漂洗膠板，每次2 min?？捡R斯亮藍(lán)R－250染色60 min(37℃，搖床轉(zhuǎn)速50 r/min)，0.25 mol/L NaCl溶液脫色。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

品種TI含量測(cè)定為3個(gè)重復(fù)，以3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅小豆品種TI含量

我國(guó)17個(gè)紅小豆品種TI含量見(jiàn)表1。17個(gè)品種 TI含量范圍為(236.0 ±13.6)～(541.1 ±12.8)TIU/g，平均值 410.8 TIU/g，品種之間高低相差 2.3倍。電泳酶譜結(jié)果顯示，紅小豆TI含量低于黑大豆，高于綠豆(圖1)。

在測(cè)試的17個(gè)品種中有4個(gè)品種超過(guò)500 TIU/g，占總數(shù)的23.5%。京農(nóng)21、遼引紅豆和XD1 TI含量最高，分別為(541.1 ±12.8)、(531.5 ±7.5)和(528.3 ±14.3)TIU/g，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值，故對(duì)這3個(gè)品種的TI作進(jìn)一步分析。

表1 不同紅小豆品種胰蛋白酶抑制劑含量(TIU/g種子)

2.2 紅小豆TI種類

用非變性電泳TI活性染色方法對(duì)TI含量最高的京農(nóng)21、遼引紅豆、XD1 TI的種類進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。紅小豆有7條TI帶，其中A4、A2和A6為主帶。種植在白城的京農(nóng)21其A2、A3含量極低或者無(wú)，而種植在北京的京紅21有A2、A3(圖2)，表明種植環(huán)境對(duì)紅小豆TI含量和種類有影響。黃國(guó)偉等［15］對(duì)1份市售小豆的TI種類進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有7條帶。據(jù)報(bào)道，TI含量與植物品種、生理狀態(tài)以及受病蟲侵害程度有關(guān)［17］。

圖1 綠豆、紅小豆、黑大豆PAGE TI譜

圖2 不同產(chǎn)地紅小豆PAGE TI譜

紅小豆、綠豆、黑大豆3種豆的TI種類不同，綠豆只有4種TI，紅小豆有7種，黑大豆有8種。

TI在生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)多種生理功能，需要不同種類及豐度的TI才能滿足要求，豆類TI多型性的生物學(xué)意義值得深入研究。

2.3 紅小豆TI熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性

經(jīng)沸水處理30 min或經(jīng)pH 1.5處理8 h，3種紅小豆TI的活性可以保存92.2%以上(表2)。Gelatin－PAGE TI譜分析表明，經(jīng)熱處理或酸處理，京農(nóng)21的A7的活性下降明顯，其他TI帶穩(wěn)定;遼引紅豆7條帶均較穩(wěn)定;XD1中7種TI對(duì)酸較穩(wěn)定，對(duì)熱穩(wěn)定性稍差(圖3)。Klomklao等［12］報(bào)道紅小豆TI經(jīng)90℃處理60 min活性未見(jiàn)重要變化，在pH 4～10室溫放置30 min未見(jiàn)失活，在pH 2～3下降約5%。據(jù)報(bào)道，紅小豆TI由82個(gè)氨基酸殘基組成，分子中含有7對(duì)二硫橋［18］，故具有很高的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。

表2 紅小豆TI穩(wěn)定性

圖3 熱、酸處理紅小豆PAGE TI譜

這些結(jié)果表明紅小豆TI耐熱、耐酸，可以應(yīng)用于各種食品熱加工工藝，口服時(shí)胃酸也不會(huì)導(dǎo)致失活，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

我國(guó)紅小豆品種平均含 TI 410.8 TIU/g，有23.5%的品種其TI含量超過(guò)500 TIU/g，表明我國(guó)有大量高產(chǎn)TI的紅小豆資源。紅小豆TI耐熱耐酸，有可能用于各種熱加工工藝防止蛋白酶引起軟化，胃中pH不會(huì)破壞其活性，是生產(chǎn)TI的潛在原料;紅小豆含7種TI，比綠豆多4種，生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)TI的種類和含量有影響。

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