龍思敏，王 群，王小平，蔡惠群，王珊珊

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)2011級，上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海中醫(yī)醫(yī)院 外二科，上海 200071)

大鼠乳腺增生病模型的建立

龍思敏1，王 群2，王小平2，蔡惠群2，王珊珊2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)2011級，上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海中醫(yī)醫(yī)院 外二科，上海 200071)

目的 建立大鼠乳腺增生疾病模型并觀察其復(fù)舊情況。方法 選用SD雌性未孕大鼠，隨機(jī)分為對照組和模型組，模型組使用肌肉注射苯甲酸雌二醇(劑量為0.5 mg/kg·d)及黃體酮(劑量為5 mg/kg·d)方法復(fù)制乳腺增生模型，造模成功后取下右側(cè)乳房，再去除造模因素飼養(yǎng)28 d后取下左側(cè)乳房，分別與對照組對應(yīng)乳房進(jìn)行比較，觀測第三對乳頭直徑、腺泡、導(dǎo)管數(shù)量以及腺泡橫徑和導(dǎo)管內(nèi)徑。結(jié)果 模型組與對照組相比，乳頭直徑(pixel)、腺泡數(shù)量(個)、直徑(pixel)、導(dǎo)管內(nèi)徑(pixel)均有增大(分別為:1.17 ±0.12 vs 0.93 ±0.097，23.75 ±5.30 vs 13.13 ±3.61，360.13 ±65.63 vs 162.50 ±33.68，236.63 ±68.28 vs 102.13 ±54.04，P均 ＜0.01);去造模因素組乳頭直徑(pixel)、腺泡數(shù)量(個)、橫徑(pixel)以及導(dǎo)管內(nèi)徑(pixel)均小于模型組，且差異有顯著性意義(分別為0.96 ±0.10 vs 1.17 ±0.12，16.50 ±5.44 vs 23.75 ± 5.30，228.50 ± 44.10 vs 360.13 ±65.63 及 162.13 ± 73.40 vs 236.63±68.28，P均＜0.01)，各組間導(dǎo)管數(shù)量差異無顯著性意義(P＞0.05)。結(jié)論 雌二醇、孕酮交替肌肉注射的方法可成功建立大鼠乳腺增生病模型，去除造模因素28 d后腺體復(fù)舊。SD大鼠乳腺增生病模型的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。

動物乳腺增生病;動物模型;雌激素

單純的乳腺增生病是由于體內(nèi)雌激素水平升高及乳腺組織所含的激素受體敏感性增高而導(dǎo)致的乳腺實(shí)質(zhì)過度增生和退行不全。目前大鼠乳腺增生模型的建立方案較為成熟，以短期外源性雌、孕激素肌肉注射或去勢造模為主［1］，但在用藥劑量、用藥時間上各有變化。本實(shí)驗(yàn)旨在建立乳腺增生病動物模型，并觀察去除造模因素28 d后乳房外觀和乳腺病理形態(tài)的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雌性SD大鼠16只，未孕，7～8周齡，體重(200±20)g，飼養(yǎng)溫度22～26℃，濕度69%，自由飲水進(jìn)食，動物及飼料均由中國科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物許可證號SCXK(滬)2012-0002。將所有大鼠編號，用excel工具隨機(jī)數(shù)功能進(jìn)行隨機(jī)分組，分為對照組8只，模型組8只。對照R組和模型組為模型建立后取材的右側(cè)乳房，對照L組及去造模因素組為模型建立后去除造模因素飼養(yǎng)28 d后取材的左側(cè)乳房。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器

苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液(均由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，0.9%氯化鈉注射液。雙目顯微鏡(Leica DM 2500)，KD-BMⅡ電腦生物組織冷凍包埋機(jī)，KEDEE石蠟切片機(jī)(KD-1508，浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，電熱恒溫水浴箱(型號H.H.S-T4，上海醫(yī)療器械五廠)。

1.3 造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，體重達(dá)平均200 g后參考黃月玲等［2］的研究予模型組大鼠每日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，連續(xù)20 d，隨后每日肌肉注射黃體酮5 mg/kg，連續(xù)5 d;對照組每日肌肉注射0.9%生理鹽水 0.2 mL，連續(xù) 25 d。

1.4 取材與測量

用精密游標(biāo)卡尺于造模前測量所有大鼠第三對乳頭直徑;造模結(jié)束后10%水合氯醛將所有大鼠麻醉，剔除胸腹部毛發(fā)，測量大鼠右側(cè)第三只乳頭直徑，以乳頭為中心，無菌狀態(tài)下做一直徑為1 cm的梭形切口將周圍皮膚連同乳腺取下，切口縫合，取下乳房組織以10%甲醛溶液固定，術(shù)后大鼠蘇醒;所有大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)28 d后脫椎處死，左側(cè)第三只乳房、乳頭測量及取材同上，乳房組織以梯度酒精、二甲苯脫水、包埋、切片、HE染色、封片，鏡下分析乳腺形態(tài)。具體測量方法如下:顯微鏡下通過Leica Qwin v3拍照采圖，在20倍物鏡和10倍目鏡下，每一標(biāo)本取2張切片，每一切片選取一個觀察指標(biāo)相對密集的視野，將2個視野所顯示的腺泡數(shù)量和導(dǎo)管數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，腺泡及導(dǎo)管直徑通過Imagepro-Plus 6.0軟件完成圖像分析，均取其平均值，使用pixel作為長度單位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間乳頭直徑、腺泡橫徑比較采取單因素方差分析，腺泡數(shù)量、導(dǎo)管數(shù)量、導(dǎo)管內(nèi)徑等數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

對照組大鼠安靜，溫順;模型組大鼠煩躁喜叫，具有攻擊性;模型組大鼠去除造模因素飼養(yǎng)28 d后警惕性強(qiáng)，易受驚。

2.2 乳頭外觀及直徑

對照組大鼠乳頭顏色與周圍皮膚相近，柔軟，扁平，貼服于皮膚，模型組大鼠乳頭較對照組充血、腫大、豎立于皮膚表面，模型組去除造模因素飼養(yǎng)28 d后乳頭顏色粉紅，較貼服于皮膚;模型組乳頭直徑(1.17 ±0.12)pixel較對照R 組(0.93 ±0.097)pixel及去除造模因素組(0.96±0.10)pixel大，差異有顯著性意義(P ＜0.01)，對照 L 組(1.01±0.16)pixel與去除造模因素組差異無顯著性意義(P＞0.05)。

2.3 乳腺組織形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)乳腺增生病理類型［3-4］鏡下觀察，對照組大鼠乳腺呈靜息狀態(tài)，腺泡形態(tài)及管腔結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量少，分布稀疏，內(nèi)不含或少部分含微量嗜酸性分泌物，周圍纖維及脂肪組織占較大比例，且形態(tài)未見明顯異常(圖1)。模型組大鼠乳腺腺泡與對照R組相比數(shù)量增多，橫徑增大(圖2)，小葉內(nèi)腺泡導(dǎo)管化并擴(kuò)張，形成微小囊腫(圖3)，大導(dǎo)管腔內(nèi)見脫落的上皮細(xì)胞或大量嗜酸性分泌物(圖4)，且大導(dǎo)管上皮可呈假復(fù)層樣增生，管壁皺褶(圖5)。去除造模因素組的乳腺與造模組相比腺泡數(shù)量減少，橫徑縮小、導(dǎo)管內(nèi)徑縮小(圖6)，差異有顯著性意義(P＜0.05)，但與對照L組相比又表現(xiàn)為腺泡數(shù)量增多，腺泡橫徑及導(dǎo)管內(nèi)徑的增大(P＜0.05)。幾個比較組間導(dǎo)管數(shù)量比較，差異均無顯著性意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 腺泡形態(tài)及管腔結(jié)構(gòu)正常(對照組HE×100)Fig 1 Normal structure of acini and ducts(Control group HE×100)

圖2 增生，腺泡數(shù)量增多，體積增大(模型組HE ×100)Fig 2 The number of acini increased(Model group HE×100)

圖3 腺泡導(dǎo)管化，形成微小囊腫(模型組HE×100)Fig 3 Cystic hyperplasia(Model group HE×100)

圖4 導(dǎo)管內(nèi)嗜酸性分泌物增多(模型組HE×100)Fig 4 Pink secretion in ducts(Model group HE×100)

圖5 導(dǎo)管上皮假復(fù)層樣增生(模型組HE×100)Fig 5 The proliferation of ductal epithelium(Model group HE×100)

圖6 腺泡縮小，結(jié)構(gòu)輕度不良(去造模因素組HE×100)Fig 6 Approximate normal breast structure(Remove the factors group HE×100)

表1 各組大鼠平均腺泡、導(dǎo)管數(shù)量，腺泡、導(dǎo)管平均直徑比較Tab 1 The quantity and diameter of acinar lumina and duct of mammary gland in groupsn

3 討論

乳腺增生病與月經(jīng)周期性激素水平變化相關(guān)，雖然目前的研究表明乳腺增生與諸多因素有關(guān)，如ER、PR受體的表達(dá)增強(qiáng)等［5］，但可以確定的是，機(jī)體內(nèi)蓄積的雌、孕激素濃度超過正常水平，是刺激乳腺組織細(xì)胞不斷增殖，造成乳腺結(jié)構(gòu)紊亂的必要因素。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為模型動物，使用雌二醇與孕酮為誘導(dǎo)物刺激導(dǎo)管、腺泡及其上皮細(xì)胞增生，發(fā)現(xiàn)鏡下乳腺組織腺泡數(shù)量增多、腺泡體積增大，導(dǎo)管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞增殖、囊性增生或各種增生形態(tài)同時存在，證明了增加外源性雌孕激素可致大鼠乳腺增生，成功復(fù)制了乳腺增生病大鼠模型。但與黃月玲等［2］、饒金才等［6］報(bào)道模型建立后去除造模因素一段時間后成模率仍舊100%的結(jié)果不一致的是，本次實(shí)驗(yàn)采取同組大鼠在模型建立后即刻取下的右側(cè)乳房與去除造模因素后飼養(yǎng)28 d取下的左側(cè)乳房相比較，出現(xiàn)了乳頭直徑、鏡下腺泡數(shù)量及腺泡橫徑的顯著差異:與增生乳腺相比較，去除造模因素后的乳腺形態(tài)的變化是腺泡數(shù)量減少、腺泡橫徑和導(dǎo)管內(nèi)徑的縮小，差異有顯著性意義;但與靜止期乳腺相比較，去除造模因素的乳腺腺泡數(shù)量有所增加，腺泡橫徑和導(dǎo)管內(nèi)徑相較于靜止期狀態(tài)也有明顯差異，說明外源性雌孕激素的作用可使乳腺呈增生狀態(tài)，且腺泡數(shù)量不可逆地增加，而外源性雌激素的撤退可使原增生增大的腺泡及擴(kuò)張的導(dǎo)管有一定程度的縮小，但無法恢復(fù)到靜止期乳腺的狀態(tài);同時也在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各組間大導(dǎo)管的數(shù)量沒有變化。與以上文獻(xiàn)結(jié)果不一致的原因可能由于觀察指標(biāo)的著重點(diǎn)不同，前者注重于判斷模型是否增生，而本次實(shí)驗(yàn)著重于根據(jù)乳腺被雌激素刺激和失去刺激所產(chǎn)生的不同反應(yīng)，觀察乳腺組織的動態(tài)變化。

動物模型建立的最終目的是為藥物篩選提供載體，由于乳腺增生病大鼠模型的建立依托于增加外源性激素，一旦去除造模因素，實(shí)驗(yàn)動物可能會因?yàn)橥庠葱约に氐闹鸩较硕陨碚{(diào)節(jié)使激素代謝到達(dá)平衡狀態(tài)，從而降低乳腺組織的增生程度，即出現(xiàn)不同程度的復(fù)舊。目前的大多數(shù)動物實(shí)驗(yàn)為了研究藥物對乳腺增生病的治療作用，在模型建立后撤除外源性激素，然后對模型進(jìn)行治療干預(yù)，觀察時點(diǎn)一般在干預(yù)30 d左右，可能忽視了動物自身對疾病的調(diào)節(jié)能力，模糊了藥物干預(yù)對模型動物疾病的轉(zhuǎn)歸程度的判定。現(xiàn)在也有一些研究在造模的同時進(jìn)行藥物干預(yù)［7-8］，可能會避免模型的復(fù)舊對藥物干預(yù)結(jié)果的干擾，但是造模同時進(jìn)行藥物干預(yù)，更側(cè)重的是預(yù)防，而不是治療。在對模型的評價或療效評價方面，多數(shù)實(shí)驗(yàn)只對增生發(fā)生率，或增生程度，如輕度增生、重度增生出現(xiàn)率之間的比較［9］，針對腺體形態(tài)進(jìn)行量化評估和動態(tài)監(jiān)測的觀察方法［10］相對較少，本次實(shí)驗(yàn)著重于觀察大鼠乳腺腺泡、導(dǎo)管數(shù)量和直徑在靜止期、增生期以及去除造模因素后的動態(tài)變化，其結(jié)果提示在藥物治療干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究中，需要考慮是否需要維持外源性雌激素的持續(xù)刺激避免模型的自然復(fù)舊，以確保對藥物療效的觀察。在后續(xù)研究中本研究組將改進(jìn)模型建立方法，并增加生化指標(biāo)進(jìn)行機(jī)制的探討。

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Establishment in rat cyclomastopathy

LONG Si- min1，WANG Qun2，WANG Xiao - ping2，CAI Hui- qun2，WANG Shan - shan2
(1.Grade2011，Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai201203，China;2.Department of Surgery，Shanghai Traditional Chinese Medicine Hospital，Shanghai200071，China)

［Abstract］ObjectiveTo establish the model of hyperplasia of mammary gland in rat and observe the redintegration of the breast.MethodsSD female non-pregnant rats were randomized into 2 groups:normal group and model group.Model group received muscular injection of(0.5 mg/kg·d)and progesterone(5 mg/kg·d)to induce hyperplasia of mammary glands.After the modeling，right breasts taken from all of rats，then the opposite breasts would be taken after 28 days with conventional feeding，both breasts of model group compared with the control group respectively by diameter of the third nipples，the quantity and diameter of acinar lumina and duct of mammary gland.ResultsCompare with control group，the diameter of the nipple，the quantity and diameter of acinar lumina and ducts of mammary gland in model group increased significantly(diameter of the nipple:1.17 ±0.12 vs 0.93 ±0.097，the quantity of acinar lumina:23.75 ±5.30 vs 13.13 ±3.61，the diameter of acinar lumina:360.13 ± 65.63 vs 162.50 ± 33.68，the diameter of duct:236.63 ± 68.28 vs 102.13 ±54.04.P＜0.01)，but compare with the model group，they reduce in remove the factors group(diameter of the nipple:0.96 ±0.10 vs 1.17 ±0.12;the quantity of acinar lumina:16.50 ±5.44 vs 23.75 ±5.30;the diameter of acinar lumina:228.50 ±44.10 vs 360.13 ±65.63;the diameter of duct:162.13 ±73.40 vs 236.63 ±68.28，P＜0.01)，there was no significant difference in quantity of ducts among groups(P＞0.05).ConclusionA great quantity of ectogenic estradiol can induce mammoplasia，but without exogenous estrogen the model will be redintegrated after 28 days.

［Key words］animal mammary gland;animal model;estrogen

R285.5

A

1671-7295(2013)05-0434-04

龍思敏，王群，王小平，等.大鼠乳腺增生病模型的建立［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5):434-437.

10.11724/jdmu.2013.05.06

上海市中醫(yī)臨床優(yōu)勢專科(專病)第三批建設(shè)項(xiàng)目(ZYSNXD-YL-YSZK010)

龍思敏(1988-)，女，廣西柳州人，碩士研究生。E-mail:83289953@qq.com

王 群，副主任醫(yī)師。E-mail:dinolancet@gmail.com

2013-06-18;

2013-09-02)