王文娟，武曉寧，賈玉潔，谷 成，閔連秋△

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧錦州 121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001）

近些年來，糖尿病合并腦梗死的發(fā)病率逐年升高，給人們的健康帶來了嚴(yán)重的威脅。糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能加重神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，增加了腦梗死的致殘率和病死率，嚴(yán)重地影響了患者預(yù)后的生活質(zhì)量。有關(guān)糖尿病加重腦梗死的機(jī)制近年來研究較多，但具體機(jī)制至今尚未明確［1］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討大鼠局灶性腦缺血早期Ras／Raf／絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivatedp rotein kinase kinase，MEK）／細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）信號傳導(dǎo)通路的作用，以及糖尿病加重腦梗死與Ras／Raf／MEK／ERK傳導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～330g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號［SCXK（遼）2003－0007］。PD98059 由 德 國 默 克 公 司 提 供 （批 號 51300I）；p－ERK1／2一抗、二抗均由北京博奧森生物有限公司提供，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶接到的dUTP原位切口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿?。═2DM）大鼠腦缺血模型的建立 取SD大鼠常規(guī)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后喂飼高脂高糖飼料（10%豬油，2.5%膽固醇，1.0%豬膽酸鹽，20.0%糖，66.5%常規(guī)飼料［2］）。4周后，按25.0mg／kg［3］體質(zhì)量的劑量一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液。72h后取尾血測血糖，血糖超過16.7mg／kg為T2DM大鼠［4］。選取T2DM造模成功的SD大鼠，按照文獻(xiàn)［5］制作大鼠大腦中動脈缺血模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。麻醉后的SD大鼠頸部正中切口，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈（external carotid artery，ECA）分叉部，距CCA末端約5mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線（直徑0.235mm，長6 cm）插入，以頸總動脈分叉處計(jì)算進(jìn)線深度為（18.0±0.5）mm，至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，但不插入線栓。

1.2.2 分組與給藥 將大鼠分為假手術(shù)組、健康大鼠腦缺血組、T2DM大鼠腦缺血組、PD98059組，每組12只。假手術(shù)組是選取健康大鼠只游離出動脈不進(jìn)行栓塞；健康大鼠腦缺血組是選取血糖正常，進(jìn)行MCAO造模成功的大鼠；T2DM腦缺血組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠；PD98059組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠，此組大鼠于 MCAO術(shù)前30min尾靜脈注射 PD98059（3mL／kg）。MCAO術(shù)2h后各組取6只大鼠麻醉、處死、灌流、石蠟包埋固定制成病理切片；每組剩余的6只大鼠迅速取缺血側(cè)大腦海馬，保存于－80℃冰箱。

1.2.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照Bederson 6級5分評分標(biāo)準(zhǔn)，對大鼠MCAO術(shù)后2h進(jìn)行3次神經(jīng)功能評分，平均值大于或等于2分提示造模成功，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 TUNEL法檢測大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫處理后蛋白酶K于37℃消化10 min，標(biāo)記液32℃標(biāo)記2h，后封閉30min，生物素化地高辛抗體37℃反應(yīng)37min。加SABC、DAB顯色，常規(guī)封片。在海馬CA3區(qū)不重復(fù)隨機(jī)選取5個高倍視野，在400倍光鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞（陽性細(xì)胞數(shù)／計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)）100% 。

1.2.4.2 免疫組化法檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達(dá) 采用SABC法按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行。顯微鏡下觀察缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2表達(dá)情況，每張免疫組化切片中采集5個具有代表性的高倍視野，在400倍光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA3區(qū)p－ERK1／2的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達(dá) 將凍存的腦組織剪碎置于裂解液中機(jī)械勻漿，4℃17 000r／min離心1h，取出上清液。用考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清清蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計(jì)算樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，置于沸水浴中5min使蛋白變性。制備7.5%分離膠和4%濃縮膠，將樣品加在凝膠表面的樣品槽中，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%奶粉TTBS緩沖液振蕩封閉3h后洗膜，分別加入一抗、β－actin，4℃冰箱孵育1夜。洗膜，辣根酶標(biāo)記，室溫孵育1h，洗膜后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemilum inescence，ECL）反應(yīng)1～3min，暗室曝光，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標(biāo)帶的光密度（integrated density value，DV），計(jì)算出各指標(biāo)各組目標(biāo)帶與β－actin DV比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 T2DM大鼠腦缺血組較健康大鼠腦缺血組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯增高，而PD98059組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

2.2 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2蛋白的表達(dá) p－ERK1／2陽性染色呈深棕色，常存在于神經(jīng)元胞漿中，磷酸化后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。陽性染色的神經(jīng)細(xì)胞核呈深棕色，多數(shù)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，胞核皺縮，核仁偏位或者缺失。假手術(shù)組偶見p－ERK1／2陽性蛋白表達(dá)。健康大鼠腦缺血組可見p－ERK1／2陽性神經(jīng)細(xì)胞核，T2DM大鼠腦缺血組陽性胞核增多，PD98059組陽性胞核明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3、圖1。

2.3 Western blotting測定大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白

p－ERK1／2蛋白在假手術(shù)組表達(dá)較少，在健康大鼠腦缺血組和T2DM大鼠腦缺血組表達(dá)較多，且T2DM大鼠腦缺血組增高明顯P＜0.01，而p－ERK1／2蛋白在PD98059組表達(dá)明顯減少，見表4、圖2。

2.4 TUNEL法檢測大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 凋亡的神經(jīng)細(xì)胞核為棕黃色顆粒。假手術(shù)組海馬CA3區(qū)偶見神經(jīng)細(xì)胞凋亡，健康大鼠腦缺血組缺血側(cè)海馬CA3區(qū)見較多神經(jīng)細(xì)胞凋亡，T2DM大鼠腦缺血組凋亡率較健康大鼠腦缺血組明顯升高（P＜0.01），而PD98059組凋亡率明顯下降，見表5。

表3 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2陽性細(xì)胞數(shù)

圖1 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2陽性表達(dá)（×400）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

＊：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；＃：P＜0.01，與健康大鼠腦缺血比較。

組別 n 6 0.003 2±0.000 1健康大鼠腦缺血組 6 0.012 4±0.000 2＊T2DM大鼠腦缺血組 6 0.038 4±0.001 7＊＃PD98059組 6 0.007 4±0.000 1＊＃灰度比值假手術(shù)組

圖2 Western blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白的表達(dá)

表5 大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率

3 討 論

腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是一個動態(tài)進(jìn)行的過程，在早期（30min時）缺血區(qū)會出現(xiàn)明顯的水腫，水腫區(qū)的周圍出現(xiàn)少量的凋亡細(xì)胞，隨著缺血時間的延長神經(jīng)細(xì)胞的凋亡數(shù)目增加，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞主要位于缺血半暗帶區(qū)，而缺血中心區(qū)細(xì)胞的死亡以壞死為主［6］，因此選取大鼠海馬CA3區(qū)作為觀察區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)主要研究大鼠腦缺血早期神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況及與Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系，所以選取MCAO術(shù)后2h作為觀察的時間點(diǎn)。

Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路是一條可以被多種因素廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶：（1）MAPKKK，是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Raf為其中重要的一員；（2）MAPKK，具有磷酸化蘇／酪氨酸殘基的雙特異功能，Mek為其中重要的一員；（3）MAPK是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Erk即為其中重要的一員［7］。是當(dāng)Ras受到細(xì)胞外信號刺激時，即轉(zhuǎn)化為激活型Ras，激活型Ras繼而激活Raf－1；而Raf－1可將 MEK磷酸化激活，p－MEK進(jìn)一步磷酸化ERK1／2，然后p－ERK1／2再將細(xì)胞核內(nèi)的 ElK－1L磷酸化，此瀑布式的激活過程將神經(jīng)細(xì)胞外的信號通過細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核，來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理病理過程［8］。PD98059是ERK的上游激酶 MEK－1特異性阻斷劑，能夠阻斷Ras／Raf／MEK／ERK信號通路的傳導(dǎo)，從而影響了細(xì)胞的命運(yùn)。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL染色法，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠MCAO術(shù)后2h海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化，并通過免疫組織化學(xué)、Western blotting，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠p－ERK1／2蛋白表達(dá)變化，以明確Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路是否參與了T2DM加重腦缺血損傷時的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步明確高血糖、高血脂加重腦缺血損傷的機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，與健康大鼠腦缺血組相比，T2DM大鼠腦缺血組的p－ERK1／2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01），免疫組織化學(xué)與 Western blotting結(jié)果一致。TUNEL結(jié)果顯示，健康大鼠腦缺血組有部分神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而T2DM大鼠腦缺血組凋亡率明顯升高（P＜0.01），可見高血糖、高血脂能引起P－ERK1／2蛋白上調(diào)從而加重了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

可以推論 Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路可能是T2DM加重缺血性腦損傷機(jī)制中的一條重要的信號傳導(dǎo)通路。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，阻斷了Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路僅能部分抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，經(jīng)PD98059干預(yù)的缺血組其神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），這與付度關(guān)［9］得出的結(jié)論一致，這又進(jìn)一步說明了神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的復(fù)雜性，需要更進(jìn)一步的研究。

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