蘇 偉 高 楓 孫茂民 江家貴 (南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 2400)

正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞可分泌多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管收縮與舒張。當內(nèi)皮損傷時，氧自由基生成增加，舒血管物質(zhì)如前列環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮源性舒血管因子〔(EDRF，即一氧化氮(NO)〕等釋放減少，而內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(XA2)等縮血管物質(zhì)釋放增多。血管內(nèi)皮細胞(VECs)損傷是動脈硬化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)〔1〕，當VECs受損時，可導致血壓增高、動脈硬化等疾病〔2〕。硫氧還蛋白(TRX)是機體內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，Mr為12 kD，在體內(nèi)分布廣泛，具有多種生物學功能〔3〕。研究證實，硫氧還蛋白參與機體的氧化還原反應，影響細胞的增殖和生存，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，參與某些組織的應激反應。近年來，TRX在心血管系統(tǒng)疾病中的作用也日益受到人們關(guān)注。我們在試驗中發(fā)現(xiàn)人內(nèi)皮細胞株ECV304沒有硫氧還蛋白的表達。本文對TRX基因修飾的ECV304細胞進行缺氧/復氧實驗，探討TRX其對內(nèi)皮細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ECV340(購自中科院上海細胞所)，ECV304/TRX細胞株系本室構(gòu)建，胎牛血清(杭州四季清)，1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，噻唑藍(MTT，Sigma公司產(chǎn)品)。丙二醛(MDA)及NO檢測試劑盒(南京建成生物有限公司產(chǎn)品)，ET檢測試劑盒(華美生物有限公司產(chǎn)品)。

1.2 細胞分組及缺氧/復氧模型的建立 將不同內(nèi)皮細胞分為3組:ECV304/TRX組、pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染組(空載體組)及正常對照組(ECV304組)，參照文獻〔4〕對前兩組細胞進行缺氧實驗，同時設置未缺氧的ECV304細胞作為對照組。

2 結(jié)果

2.1 TRX對缺氧/復氧的內(nèi)皮細胞內(nèi)MDA的影響 ECV304組，其細胞內(nèi)的MDA含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組，在缺氧3 h時，MDA含量顯著增加，復氧12 h時，MDA含量達到最高，然后緩慢下降;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復氧12 h時，MDA含量極顯著下降(P＜0.01)，而在24 h MDA水平下降顯著(P＜0.05)。見表1。

2.2 TRX對缺氧/復氧的內(nèi)皮細胞釋放NO的影響 ECV304組，其細胞內(nèi)的NO含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組細胞在缺氧3 h時，NO含量顯著下降，復氧12 h時，NO含量下降到最低，然后緩慢上升;ECV304/TRX組與空載體組相比，在缺氧3 h及復氧12 h時，NO含量極顯著上升(P＜0.01)，在12 h時 NO水平最高。ECV304/TRX組與ECV304組相比，在12 h時，有顯著差異。見表2。

2.3 TRX對缺氧/復氧的內(nèi)皮細胞釋放 ET-1的影響 ECV304組，其細胞內(nèi)的ET-1含量在24 h內(nèi)變化不大;空載體組，在缺氧3 h，細胞內(nèi)ET-1含量迅速上升，復氧12 h時，ET-1含量上升最高;ECV304/TRX組與空載體組相比，ET-1水平在復氧的各時間點均比有下降，在復氧24 h下降最明顯(P＜0.01)。見表3。

表1 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞MDA的影響(±s，μmol/L)

表1 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞MDA的影響(±s，μmol/L)

與轉(zhuǎn)染空載體組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別0.54±0.02 0.72±0.03 1.03±0.07 1.24±0.10空載體組 0.56±0.04 5.64±0.17 8.38±0.08 3.15±0.07 ECV304/TRX組 0.49±0.05 1.96±0.041)2)3.42±0.031)2.62±0.032)0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組

表2 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞NO的影響(±s，μmol/L)

表2 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞NO的影響(±s，μmol/L)

與空載體組比較:1)P＜0.01;與ECV304組比較:2)P＜0.05

實驗組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 54.42±7.55 56.32±7.87 58.13±7.54 62.46±7.21空載體組 51.25±6.23 30.19±5.24 23.40±5.65 35.26±5.44 ECV304/TRX組52.49±8.65 60.96±10.041)75.43±9.531)2)65.82±8.731)

表3 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

表3 TRX對缺氧/復氧不同時間點內(nèi)皮細胞ET-1的影響(±s，μmol/L)

與空載體組及ECV304組比較:1)P＜0.01

實驗組0 h 3 h 12 h 24 h ECV304組 10.52±2.12 10.42±2.15 10.63±2.09 10.24±2.10空載體組 10.48±2.11 50.56±10.04 56.64±10.17 52.38±9.08 ECV304/TRX組 10.32±2.13 30.49±5.251)25.96±5.441)22.42±4.831)

3 討論

內(nèi)皮細胞覆蓋在血管內(nèi)膜表面，具有多種重要的生理功能，參與機體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和生物活性物質(zhì)釋放等過程。在缺氧及缺氧復氧中，內(nèi)皮細胞是組織中受攻擊的第一靶器官，其中內(nèi)皮源性的舒血管因子和縮血管因子的分泌調(diào)節(jié)功能更是最先受損〔5〕。缺氧/復氧后活性氧產(chǎn)生可以透過細胞膜，在膜外與Fe2+或Cu2+生成羥自由基，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化(LPO)而導致?lián)p傷，羥自由基在缺氧再復氧損傷中起核心作用〔6〕。一旦內(nèi)皮細胞受損，其分泌血管活性物質(zhì)的功能將發(fā)生改變，通過測定VECs分泌的血管活性物質(zhì)，可判斷內(nèi)皮細胞功能，NO就是VECs損傷的敏感的標志物〔7〕。當ECV中氧自由基過多時，其與NO作用，生成一些硝基化合物，使NO減少。

本實驗說明缺氧損傷內(nèi)皮，使內(nèi)皮依賴性的血管舒縮功能紊亂，而復氧后進一步加重缺氧帶來的損傷，且缺氧及缺氧復氧帶來的損傷至少可持續(xù)至復氧后12 h，復氧24 h后內(nèi)皮依賴的血管舒縮活性有所恢復但未能完全恢復。

氧自由基大量產(chǎn)生是目前公認的缺氧及缺氧復氧造成細胞損傷的主要機制之一〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，除氧自由基外，缺氧及缺氧復氧還可通過其他機制抑制內(nèi)皮細胞NO、ET的生成。缺氧及缺氧復氧可直接作用于(NO)合成的限速酶一氧化氮合酶(NOS)，使其活性下降〔9〕;還引起生成NO的底物 L-精氨酸大量耗竭，使L-精氨酸跨膜轉(zhuǎn)運障礙，使NO生成減少〔10〕。同樣，缺氧及缺氧復氧可直接作用于ET基因，使ET轉(zhuǎn)錄增加;缺氧及缺氧復氧還刺激凝血系統(tǒng)，使凝血酶生成增加，通過凝血酶刺激 ET 大量生成〔11，12〕。

TRX能升高缺氧-復氧環(huán)境下ECV中NO的釋放，可能是通過降低缺氧/復氧ECV產(chǎn)生氧自由基的量，減少氧自由基對NO的滅活;同時，TRX也可能通過活化NOS，使NO含量顯著升高而抗ECV損傷。

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