付 琳，裘宇容，姜云飛，夏佳音，王海芳

（1．南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院臨床檢驗中心，廣東 廣州510515；2．廣州市哈畢特實驗儀器有限公司，廣東 廣州510730）

2010年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會和歐洲風(fēng)濕病學(xué)聯(lián)盟聯(lián)合制定了新的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷分類標準［1］，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP）被列入新的診斷標準中，成為診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的新的血清學(xué)指標。目前，檢測抗CCP抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和化學(xué)發(fā)光分析法（CLIA）。ELISA法靈敏度較高，試劑成本較低，不需要昂貴的儀器設(shè)備，可在臨床上廣泛使用；但是，ELISA方法時間檢測時間長，操作繁雜，不適合單個零散標本的檢測，且需手工操作，檢測線性范圍窄，不易標準化。CLIA法檢測高度敏感，特異性及重復(fù)性較好，檢測范圍寬，試劑穩(wěn)定無毒害無污染，操作簡單，檢測過程耗時短，而且易于自動化以及單個樣本的檢測；但是CLIA法成本高收費貴，發(fā)光劑的發(fā)光性能難以穩(wěn)定。為此開展一種新型的檢測方法用于抗CCP抗體的檢測，不僅可以縮短標本的檢測時間，而且降低檢測成本已成為CCP抗體檢測的主要發(fā)展方向。研究開發(fā)一種新的試劑用于生化分析儀上檢測，由于CCP多肽是小分子多肽，采用生化分析儀難以直接檢測，因此必須將CCP與固相載體結(jié)合，增加其反應(yīng)面積從而提高檢測靈敏度。本研究即是探索顆粒型環(huán)瓜氨酸肽抗原的制備并對實驗條件進化，為后續(xù)用于生化分析儀的測定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和儀器

膠乳微球（粒徑160nm），美國Bangslabs公司提供；瓜氨酸環(huán)肽，杭州中肽公司合成；牛血清白蛋白BSA、1－乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS），均為美國sigma公司生產(chǎn)；Bradford測蛋白試劑盒，南京凱基生物公司提供；其余所用化學(xué)試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

寧波新芝生物科技股份公司JY－92II型超聲波細胞粉碎機；美國MD－SpectraMax M5多功能酶標儀。

1．2 實驗方法

1．2．1 CCP多肽合成 由杭州中肽公司根據(jù)我們提供的氨基酸序列用Fmoc化學(xué)法合成，合成后經(jīng)RP－HPLC純化使?jié)舛却笥?5%。根據(jù)杭州中肽公司提供合成樣品的氨基酸序列分析資料、樣品的HPLC分析圖譜及樣品的質(zhì)譜圖，證實合成物為CCP。

1．2．2 CCP與BSA偶聯(lián)蛋白的制備 取BSA溶解于PH9．0碳酸鹽緩沖液中，加入適量檸康酸酐，室溫反應(yīng)過夜。凝膠過濾除去多余的檸康酸酐。修飾后的BSA通過EDC反應(yīng)與CCP偶聯(lián)，通過對BSA與CCP偶聯(lián)量、偶聯(lián)pH及偶聯(lián)時間進行優(yōu)化，最終使CCP與BSA偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白大小在70－170kD之間，紫外吸收峰相對于BSA產(chǎn)生左移。然后在pH3．5的醋酸鹽緩沖液中還原已被封閉的氨基，37℃反應(yīng)2h，4℃透析過夜，濃縮干燥備用。

1．2．3 膠乳顆粒偶聯(lián)方法 取0．1ml羧基化膠乳微球，加入0．9ml乙磺酸緩沖液（MES）混合均勻后加入EDC和NHS活化，室溫條件下溫和攪拌15 min。12 000g離心15min，用0．1mol／L磷酸緩沖液（PBS）重復(fù)清洗沉淀3遍，去上清，沉淀經(jīng)0．1 mol／L PBS重懸、振蕩、超聲處理后即得到活化的膠乳微球。取2mg BSA－CCP溶于PBS，加入到1 ml經(jīng)過活化的膠乳微球溶液中，室溫條件下溫和攪拌，達到反應(yīng)時間后，12 000g離心15min，沉淀用含有0．05%Tween20的PBS重復(fù)清洗3遍，收集上清液，檢測上清液中未反應(yīng)的蛋白含量。

1．2．4 蛋白偶聯(lián)量的測定

蛋白偶聯(lián)量通過Bradford法檢測反應(yīng)前后溶液中的蛋白質(zhì)含量變化求得：蛋白偶聯(lián)量＝（加入蛋白總量—洗滌液中蛋白量）∕加入蛋白總量×100%，重復(fù)實驗3次，取平均值得蛋白偶聯(lián)的平均效率。

2 結(jié)果

2．1 CCP－BSA偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白

根據(jù)先前文獻報道及蛋白特征，對BSA與CCP偶聯(lián)條件進行篩選。BSA與CCP偶聯(lián)質(zhì)量比為1∶1，EDC與NHS用量比為2∶3，偶聯(lián)PH為6．0，BSA與CCP偶聯(lián)可以達到較好的效果。BSA與CCP偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白條帶單純BSA條帶相比有明顯差異。SDS－PAGE電泳圖（圖1）表明，BSA和CCP的偶聯(lián)產(chǎn)物的電泳條帶則出現(xiàn)在70KD－170KD之間不等。由于實驗中無法控制CCP交聯(lián)的數(shù)量，所以會產(chǎn)生不等條帶的現(xiàn)象。紫外吸收光譜可以看出BSA在280nm處出現(xiàn)特征性吸收峰，BSA與CCP偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白的紫外吸收峰有明顯左移，符合偶聯(lián)蛋白的特征，如圖2。

2．2 160nm羧基化膠乳微球偶聯(lián)條件優(yōu)化結(jié)果

2．2．1 EDC用量對偶聯(lián)的影響

在相同條件下，取0．1ml微球（10mg干微球），加入pH6．0MES緩沖液中。取不同量的EDC以及NHS（EDC與NHS等量），混勻，室溫反應(yīng)15 min，洗滌，超聲波重懸。取2mg BSA－CCP偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白，與活化微球混勻，室溫反應(yīng)2h，洗滌，檢測上清液中蛋白含量。偶聯(lián)結(jié)果如表1，EDC含量為0mg時，微球與偶聯(lián)蛋白之間為物理吸附，吸附效率為19．67%。隨著EDC用量由2．5mg／ml增加到10mg／ml，偶聯(lián)蛋白的量也隨之增加抗體的偶聯(lián)效率由36．5%上升到63．66%，當EDC用量達到7．5mg／ml時，偶聯(lián)蛋白效率達到63．66%，之后隨著EDC用量的增加，偶聯(lián)蛋白效率不再增加。EDC最佳用量為7．5mg／ml。

圖1 BSA－CCP偶聯(lián)產(chǎn)物SDS－PAGE電泳圖

圖2 BSA－CCP偶聯(lián)抗原蛋白OD200－400掃描鑒定結(jié)果

表1 不同EDC用量對偶聯(lián)效果的影響

2．2．2 偶聯(lián)時間的優(yōu)化

EDC用量和緩沖液pH恒定的條件下（EDC用量7．5mg／ml，pH7．5），分別在反應(yīng)0h、0．5h、1h、2h、3h、4h測定蛋白偶聯(lián)微球的效率。偶聯(lián)時間對微球偶聯(lián)效率的影響如圖3所示，隨著偶聯(lián)時間的延長，蛋白偶聯(lián)微球的效率不斷增加，在偶聯(lián)時間為0．5－2h內(nèi)，偶聯(lián)效率增加最快，當反應(yīng)時間2h后，反應(yīng)趨于平衡。因此，最佳的偶聯(lián)時間為2－4h。

2．2．3 反應(yīng)PH值的優(yōu)化

采用水溶性碳二亞胺活化微球表面羧基，共價偶聯(lián)制備的偶聯(lián)產(chǎn)物蛋白，結(jié)果表明，緩沖液pH對偶聯(lián)有較大的影響。用0．1mol／L磷酸鹽緩沖液（PB），恒定其他反應(yīng)條件不變（EDC用量為7．5 mg／mL，反應(yīng)時間為2h）。反應(yīng)前偶聯(lián)蛋白含量均為2mg，調(diào)節(jié)緩沖液的pH 分別為6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5，進行蛋白偶聯(lián)，在同樣條件下，測定偶聯(lián)前加入蛋白濃度和偶聯(lián)后上清液的蛋白濃度，得到微球偶聯(lián)蛋白量。由圖4可見，pH為7．5時偶聯(lián)效果最好，pH7．0－8．0為適宜偶聯(lián)的pH范圍。

3 討論

有研究證明，關(guān)節(jié)滑膜組織中的瓜氨酸化蛋白在RA發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。這種有抗原驅(qū)動和T淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)被認為是RA發(fā)病的啟動因子［2］。環(huán)瓜氨酸肽是21個氨基酸的多肽，其序列為其序列為HQCHQESTXGR SRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通過第3和第16位的半胱氨酸巰基氧化而形成環(huán)肽［3］。采用人工合成的CCP作為抗原檢測抗CCP抗體的方法，已成為目前檢測抗CCP抗體的主要方法。

聚苯乙烯微球是一種由苯乙烯聚合而成的高分子材料，表面帶有功能基團，活化后可通過共價鍵結(jié)合蛋白質(zhì)、酶、抗體、細胞等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于免疫測定，親和層次及臨床診斷等領(lǐng)域［4，5］。包被有抗體／抗原的膠乳微球已被廣泛應(yīng)用于免疫診斷中，將不同的抗原／抗體連接在膠乳微球表面，通過免疫檢測，可將一些常見疾病，如肝炎、流感等快速檢測出來［6，7］。常用的制備膠乳－蛋白復(fù)合物的方法有兩種：物理吸附法和共價偶聯(lián)法。由于吸附會引起固定于膠乳微球表面蛋白的部分解吸及結(jié)構(gòu)的變化，所以用物理吸附法制備的膠乳－蛋白復(fù)合物特異性低，在生物診斷中的應(yīng)用受到限制。共價偶聯(lián)法能在最大限度上控制吸附法中出現(xiàn)的問題，成為目前制備膠乳－蛋白復(fù)合物的主要方法。

本研究首先將CCP和一種無關(guān)蛋白（BSA）通過化學(xué)偶聯(lián)方法共價偶聯(lián)，后續(xù)采用BSA作為交聯(lián)臂使CCP間接偶聯(lián)到膠乳微球上，為后續(xù)建立檢測抗CCP抗體方法奠定基礎(chǔ)。采用的偶聯(lián)載體是帶有－COOH活性基團的聚苯乙烯微球。羧基化微球與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)是氨基和羧基間的成酰胺鍵反應(yīng)，在EDC以及NHS活化羧基與蛋白分子上的氨基之間進行。結(jié)果顯示，EDC活化羧基與蛋白分子的氨基之間的反應(yīng)受到多種因素的影響，如EDC用量、偶聯(lián)時間、反應(yīng)pH等。羧基化微球經(jīng)過EDC和NHS活化形成較穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物的很容易和氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，所以羧基活化是偶聯(lián)反應(yīng)的重要部分，羧基基團的活化直接影響蛋白偶聯(lián)效率。而羧基活化多少與EDC用量有直接關(guān)系，EDC用量太少則不足以活化微球上的羧基，偶聯(lián)效率較低；EDC用量過大則會使微球表面的羧基完全活化，蛋白偶聯(lián)效率不會持續(xù)上升而是趨于平衡，造成不必要的浪費。若偶聯(lián)時間過短，蛋白質(zhì)則不能充分有效的和活化的微球反應(yīng)；若偶聯(lián)時間過長，蛋白偶聯(lián)量達到飽和并且會出現(xiàn)一定程度的下降，而且長時間的反應(yīng)可能會使蛋白分子在反應(yīng)過程中氧化變性，蛋白偶聯(lián)效率降低。另外，由NHS介導(dǎo)的EDC兩步法偶聯(lián)反應(yīng)，EDC活化羧基與NHS形成較穩(wěn)定活化酯中間產(chǎn)物，同蛋白分子上的氨基反應(yīng)一般在pH7－8之間進行。過高或者過低pH條件下，蛋白分子容易變性失活，從而不利于后續(xù)研究的進行。

本研究通過間接方法將CCP抗原肽共價偶聯(lián)到膠乳微球上。而偶聯(lián)上的CCP抗原肽在一定條件下可以與抗CCP抗體特異性結(jié)合，因此可用于抗CCP抗體的檢測。近年來，國內(nèi)有不少研究微球和抗體偶聯(lián)的報道［8，9］，報道微球與抗體的偶聯(lián)效率一般在16．8%～60%。本研究結(jié)果探索了聚苯乙烯微球與自制的CCP抗原肽偶聯(lián)蛋白的最佳偶聯(lián)條件，可使蛋白偶聯(lián)效率達到60%以上，為建立簡便快速檢測抗CCP抗體的方法奠定了良好的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。

［1］Cohen S，Emery P．The American College of Rheumatology／European League Against Rheumatism criteria for the classification of rheumatoid arthritis：agame changer［J］．Arthritis Rheum，2010，62（9）：2592．

［2］虞 偉，張 瑾，顧晨曦，等．三種不同固相化方法用于抗環(huán)瓜氨酸肽抗體測定的研究［J］．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，31（11）：1227．

［3］Schellekens G A，Visser H，de Jong B A，et al．The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide［J］．Arthritis Rheum，2000，43（1）：155．

［4］Murray D L，Ryu E，Snyder M R，et al．Quantitation of serum monoclonal proteins：relationship between agarose gel electrophoresis and immunonephelometry［J］．Clin Chem，2009，55（8）：1523．

［5］Vihola H，Marttila A K，Pakkanen J S，et al．Cell－polymer interactions of fluorescent polystyrene latex particles coated with thermosensitive poly（N－isopropylacrylamide）and poly（N－vinylcaprolactam）or grafted with poly（ethylene oxide）－macromonomer［J］．Int J Pharm，2007，343（1－2）：238．

［6］Garcia V S，Gonzalez V D，Caudana P C，et al．Synthesis of latexantigen complexes from single and multiepitope recombinant proteins．Application in immunoagglutination assays for the diagnosis of Trypanosoma cruzi infection［J］．Colloids Surf B Biointerfaces，2012，101（C）：384．

［7］Finney H，Newman D J，Gruber W，et al．Initial evaluation of cystatin C measurement by particle－enhanced immunonephelometry on the Behring nephelometer systems（BNA，BN II）［J］．Clin Chem，1997，43（6Pt 1）：1016．

［8］王啟輝，劉金華，周 潔，等．穿膜肽－抗體－微球偶聯(lián)物的制備方法研究［J］．黑龍江醫(yī)藥，2011，24（4）：558．

［9］王 愷，馬光輝．白蛋白微球的制備、改性和應(yīng)用的研究進展［J］．國際藥學(xué)研究雜志，2003，30（6）：366．