于永忠，王歡，譚強，趙文博，崔玉東

（黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶163319）

人羊膜上皮細胞（Human amniotic epithelial cell，hAEC）位于羊膜的最內層，此類細胞擁有干細胞特性，在一定條件下可以向內胚層（如肝細胞）、中胚層（如心肌細胞）和外胚層（如神經(jīng)細胞）等3種胚層細胞分化[1]。hAEC在治療中樞神經(jīng)障礙方面具有獨特的應用價值，1996年，Sakuragawa等[2]最先發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的hAEC表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的標志。隨后的研究表明，培養(yǎng)的hAEC能合成和釋放神經(jīng)遞質如乙酰膽堿，兒茶酚胺和多巴胺。hAEC移植治療大鼠帕金森?。≒D）的實驗表明其在體內不僅能存活并表達絡氨酸羥化酶（TH）活性，而且可以逆轉病情和防止神經(jīng)元死亡。hAEC對于靈長類的脊髓損傷同樣具有良好的治療效果。目前hAEC已應用于溶酶體蓄積病、神經(jīng)細胞退行性病變以及眼科疾病的治療。hAEC已被證實具有肝細胞的某些特性和功能。Takashima等[3]在hAEC進行原代培養(yǎng)鑒定過程中，采用肝細胞生長因子和地塞米松等為誘導劑處理方法，使得hAEC逐步具備了分化為成熟肝細胞的潛能。

“羊口瘡”（ORF）是由羊傳染性膿皰皮炎病毒（ORFV）引起的一種急性、接觸性的動物傳染病[4]，主要危害羊的口唇、蹄和外陰等部位皮膚，尤其是黏膜皮膚邊緣及分泌性粘膜，導致以紅斑、丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征的病變過程。該病在破壞強度上雖然僅造成皮膚或黏膜局部增生性損傷，甚至沒有系統(tǒng)性感染癥狀，但病毒能夠伺機長期潛伏于宿主皮膚內并演變?yōu)槌掷m(xù)感染和繼發(fā)感染。同時，ORFV也能感染人類[5-6]。由于ORFV只感染上皮細胞，病毒對于hAEC是否敏感有待于進一步明確。實驗以hAEC為對象進行適宜的原代培養(yǎng)，同時應用不同生長因子刺激和ORFV感染觀察hAEC細胞敏感性，旨在研究ORFV與細胞相互作用特點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Ⅳ型膠原酶（美國Gibco公司）；DMEM高糖培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（JRH，Bioscience）（美國Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Amresco公司）；10×青-鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；人重組堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國Gibco公司）；人重組表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（美國Gibco公司）；ORFV毒株（OV/HLJ/04）由黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院細胞生物學教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 hAEC的制備及原代培養(yǎng)

健康的人羊膜（試驗材料），來源于HIV、甲肝、乙肝及梅毒等病原物生物血清學反應陰性的產婦胎盤（經(jīng)家屬同意）。用預先消毒的彎頭鑷子先將羊膜與絨毛膜進行輕微鈍性剝離，然后將羊膜放置于含雙抗（青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100μg·mL-1）的無菌PBS中沖洗數(shù)遍。再將漂洗后的羊膜用預先消毒的眼科剪剪成約1 mm×1 mm的組織塊，隨后加入0.2%的膠原酶Ⅳ于37℃下消化2.5 h；之后加入適量PBS稀釋后1 000 r·min-1離心3～5 min，輕輕吸出膠原酶消化液；向沉淀中加入0.25%的胰蛋白酶消化液，37℃振蕩消化30～50 min，消化后加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化；最后使用400目篩網(wǎng)過濾細胞，棄掉雜質，將濾液1 000 r·min-1離心5min，收集其中的上皮細胞，將細胞鋪于細胞培養(yǎng)板，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。hAEC原代培養(yǎng)、傳代具體方法如下：將要培養(yǎng)的上皮細胞利用不同成分的培養(yǎng)基制備成細胞懸液，細胞計數(shù)后調整為1×105個·mL-1的密度，種植于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，2 d換液1次。待細胞鋪滿90%板底時，用預溫的0.25%的胰蛋白酶37℃消化細胞2～3 min，待消化細胞大部分分離甚至脫落，用無菌PBS終止消化。收集消化好的細胞，1 000 r·min-1離心3min，棄上清。加入新的培養(yǎng)液，重懸細胞，再分裝新的培養(yǎng)板，補充培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。利用倒置顯微鏡逐日觀察不同細胞培養(yǎng)液中hAEC形態(tài)、生長和增殖情況，以確定最適宜hAEC原代培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)液。

1.2.2 hAEC在EGF和bFGF環(huán)境下生長的差異性

hAEC在EGF和bFGF環(huán)境下能夠加快生長速度。在培養(yǎng)基中，分別添加適量的EGF和bFGF，并已基本培養(yǎng)基作為對照，驗證兩種不同細胞因子對于hAEC生長影響的差異性。hAEC培養(yǎng)液配制：將10 cm培養(yǎng)板分3組：組1，培養(yǎng)液內添加90%DMEM、10%胎牛血清、40 ng·mL-1的EGF；組2，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF；組3，對照組，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清。具體如表1所示。

表1 hAEC培養(yǎng)基不同組分Table1 Medium with different components for hAEC

1.2.3 hAEC生長曲線測定

原代細胞培養(yǎng)傳代穩(wěn)定后，取傳代hAEC單細胞懸液（1×105個·mL-1）均勻接種于7塊96孔板中，每塊板設置3組，每組接種5個小孔 ，培養(yǎng)基使用量為每孔200μL，然后放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；從接種細胞的第2 d起每天取一塊板檢測，檢測前加入4mg·mL-1的MTT液（每孔50μL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后吸棄小孔內培養(yǎng)液，加入DMSO液（每孔150μL），再將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上震蕩約10 min，使結晶物溶解；利用酶標儀檢測各孔檢測OD570nm值，計算各時相點吸光度的平均值，記錄結果。在繪制細胞生長曲線時，將橫坐標設定為時間（d），縱坐標設定為吸光度（表示細胞相對數(shù)量）OD570nm值。

1.2.4 hAEC的ORFV感染實驗

將10-5TCID50的ORFV按照不同的稀釋濃度分別加入到24孔細胞培養(yǎng)板中，未接毒的設為陰性對照。病毒稀釋比例為1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640等8個梯度。96孔板每孔加入病毒稀釋液10μL。接毒后，將細胞板放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，做好細胞病變觀察記錄。

2 結果

2.1 hAEC的制備及原代培養(yǎng)結果

在倒置顯微鏡下可以觀察到，經(jīng)膠原酶IV和0.25%胰蛋白酶消化過的細胞大多數(shù)分散存在，偶爾能夠看到幾個細胞聚合在一起組成細胞團塊。在原代細胞培養(yǎng)2～4 h后，可見大部分細胞開始貼壁。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，細胞形態(tài)逐漸趨向多角形（圖1所示）。最初細胞不好辨認，有些細胞邊緣不清晰，胞體有些透明；當培養(yǎng)接近10 d左右，細胞生長一定數(shù)量，細胞變得致密，有層次感，在板底形成一定“紋理”。鋪滿板底70%～80%時可傳代。

圖1 hAEC原代培養(yǎng)結果（A：3 d；B：10 d）（500×）Fig.1 Primary culture of hAEC（day 3 to day 10）

2.2 不同的生長因子對于hAEC生長速度

將hAEC分別用不同成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)，結果表明，組1（A：培養(yǎng)24 h；B：培養(yǎng)48 h）培養(yǎng)液內添加90%DMEM、10%胎牛血清、40 ng·mL-1的EGF，細胞生長速度比對照組明顯加快；組2（C：培養(yǎng)24 h；D：培養(yǎng)48 h），培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF，細胞生長速度比組1，細胞紋理清晰表明細胞相對致密，可以此作為生長迅速的證據(jù)之一；組3（E：培養(yǎng)24 h；F：培養(yǎng)48 h）是對照組，培養(yǎng)液為90%DMEM、10%胎牛血清。結果說明bFGF和EGF加速了hAEC的生長，而未添加生長因子的細胞生長緩慢。而且，添加組細胞培養(yǎng)3d就可以達到普通培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d的效果（圖2、表2所示）。

2.3 hAEC的生長曲線

將第2代hAEC細胞通過MTT法，用酶標測定儀測定細胞培養(yǎng)物的OD570nm值。根據(jù)OD570 nm值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。在第1～3 d細胞個數(shù)值逐漸上升，為生長緩滯期。第4～7 d，細胞數(shù)目明顯的增加，為細胞生長對數(shù)期。第8～10 d，細胞的數(shù)目輕微增加，為平臺期。第15 d后，細胞生長停滯，并伴有一定數(shù)量的細胞發(fā)生死亡。以細胞數(shù)×1 000為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線，如圖3所示。

圖2 添加不同的生長因子對于hAEC生長速度的影響（500×）Fig.2 The influence of growth rate by various growth factor（bFDF，EGF）for hAEC

表2 不同組分培養(yǎng)基的hAEC生長差異性Table2 Dissimilarity of hAEC growth under different components of themedium

圖3 hAEC的生長曲線Fig.2 The growth curve of hAEC incubated

2.4 病毒感染病變結果

在細胞接毒之后72 h內，通過細胞病變效應（CPE）觀察，如圖4所示，正常細胞（A）接毒后，經(jīng)過24 h，細胞狀態(tài)變化很明顯。B代表細胞接毒24 h的狀態(tài)；C代表細胞接毒48 h的狀態(tài)；D代表細胞接毒72 h的狀態(tài)。其中，在48 h后發(fā)生病變。顯微鏡觀察到有部分細胞皺縮，細胞變圓，壞死，從培養(yǎng)板底部脫落等現(xiàn)象。結果表明，hAEC細胞對病毒ORFV存在敏感性，說明ORFV對于hAEC有一定的侵染能力。

圖4 hAEC在ORFV感染后CPE結果Fig.4 The results of CPE of hAEC after infection by ORFV

3 討論

羊膜（Amnion）覆蓋于羊膜腔內表面，其厚度為0.02～0.05 mm，是人體中最厚的基底膜。hAEC位于羊膜的最內層，在受精后第8 d從外胚葉發(fā)育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性。研究表明，hAEC在遺傳學上具備干細胞的某些特性[7]，因而很有希望成為干細胞移植的候選細胞。hAEC體外培養(yǎng)的難點是原代培養(yǎng)過程[8]中形成穩(wěn)定的細胞系，而原代培養(yǎng)的成功與否很大程度決定于能否獲得足夠數(shù)量活性強、品種純的上皮細胞。在研究中，我們采用多次消化法[9]獲得上皮細胞進行培養(yǎng)，同時借鑒了其他學者研究的經(jīng)驗[10]，將兩種酶交替使用。首先用膠原酶IV處理羊膜組織，分解間質組織等強韌成分，進而獲得成片的上皮細胞，然后再用胰蛋白酶多次消化細胞，這樣得到的上皮細胞比較多，而且細胞的損傷小、完整性好、質量高，細胞容易貼壁成活。實際上，表皮生長因子（EGF）具有多種生物活性，能刺激hAEC分裂和增生；堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對來源于中胚層和外胚層的細胞具有很強的促分裂作用，而對于hAEC也有較強的促進作用。鏡下觀察hAEC對bFGF和EGF存在的應激性，發(fā)現(xiàn)hAEC在bFGF的刺激下，細胞形態(tài)變化也較大，由原來的圓形變成梭形，可能與bFGF的促成纖維細胞增殖有關。而EGF對hAEC的刺激也反映出與EGF作用濃度有關，可能是因為不同濃度的EGF啟動的細胞分裂或分化信號通路不同所致。細胞培養(yǎng)結果表明，在第15 d左右，細胞出現(xiàn)萎縮死亡跡象，可能是因為hAEC缺乏端粒酶[11]。鑒于這兩種生長因子在胚胎干細胞或間充質細胞等的分化中獨特作用[12]，我們也將進一步深入研究其中的機制。

ORFV主要引起上皮細胞病變，但與上皮細胞間存在復雜的作用關系，用RNAi技術可能實現(xiàn)針對病毒復制的抑制作用[13]。hAEC在ORFV作用下病變明顯，可以提供病毒感染機制研究的細胞模型，對于探尋ORFV在感染非許可細胞的病變機制將起到積極的促進作用。

[1]Miki T，Lehmann T，Cai H，et al.Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells[J].Stem Cells，2005，23（10）：1549-1559.

[2]Sakuragawa N，Misawa H，Ohsugi K，et al.Evidence for active acetylcholine metabolism in human amniotic epithelial cells：applicable to intracerebral allografting for neurologic disease[J].Neurosci Lett.1997，22（1）：53-56.

[3]Takashima S，Ise H，Zhao P，et al.Human amniotic epithelial cells possess hepatocyte-like characteristics and functions[J].Cell Struct Funct，2004，29（3）：73-84.

[4]Mercer AA，Haig DM.Parapoxviruses，the encyclopedia of virology[M].2nd ed.New York：Academic Press，1999.

[5]Brandt TA，Jacobs BL.Both carboxy-and amino-terminal domains of the vaccinia virus interferon resistance gene，E3L，are required for pathogenesis in amousemodel[J].JVirol.2001，75（2）：850-856.

[6]Robinson AJ，Ballassu TC，Contagious pustular dermatitis orf[J].Vet.Bull，1981，51：771-782.

[7]金玲，陳劍，吳靜，等.人羊膜上皮細胞的肝細胞特性[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（19）：732-738.

[8]劉小勇，陳劍，吳靜，等.人羊膜上皮細胞的原代及傳代培養(yǎng)[J].廣東醫(yī)學，2007，28（2）：181-183.

[9]張春，車玉梅.應用胰蛋白酶/DNA酶消化法分散人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2011，22（2）：232-241.

[10]方寧，宋秀軍，張路，等.人羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J].遵義醫(yī)學院學報2009，32（2）：432-437.

[11]郭禮和.人羊膜上皮細胞具有胚胎干細胞和移植免疫耐受等優(yōu)良特性[J].中國細胞生物學學報，2011，33（4）：451-454.

[12]吳其全，張勝利，周君梅，等.胚胎干細胞和間充質干細胞分化為內皮細胞的研究現(xiàn)狀[J].國際生物醫(yī)學工程雜志，2009，22（2）：108-112.

[13]于永忠，郭雯，吳欣媛，等.靶向ORFV-DNA ploymerase基因shRNA表達載體的構建[J].黑龍江八一農墾大學學報，2012，24（4）：38-41.