張春艷，王遂泉，吳辛剛，歐陽杰，林福全，洪為松，許愛娥

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第三人民醫(yī)院，杭州310009）

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚黏膜疾病，人群中的發(fā)病率為1%～2%，臨床上易于診斷而難于治療，嚴重影響美觀，給患者帶來極大的困擾，進而影響了患者的生活質(zhì)量。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在影響白癜風(fēng)黑素細胞生存及黑素代謝過程中占有重要的作用，是其發(fā)病機制之一，患者表皮內(nèi)的過氧化氫（H2O2）的累積，導(dǎo)致黑素細胞形態(tài)和功能改變，進而導(dǎo)致白斑的出現(xiàn)[1-3]。針對此發(fā)病學(xué)說，一些抗氧化劑被用于白癜風(fēng)的治療,其通過減弱H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，阻斷H2O2對黑素細胞的破壞作用，從而取得較好療效[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，許多植物提取物都具有抗氧化作用,在疾病治療方面療效好，不良反應(yīng)小，應(yīng)用前景廣闊[6]。本實驗應(yīng)用氧化應(yīng)激模型研究9種植物提取物對黑素細胞的抗氧化保護作用，以篩選用于治療白癜風(fēng)的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及來源 B10BR細胞（鼠的永生化黑素細胞）：美國耶魯大學(xué)皮膚科實驗室惠贈。

1.1.2 藥物1 mol/L H2O2（純度99%，-20℃分裝避光冷藏） 購于美國Sigma公司，臨用時室溫下融解后，用緩沖液調(diào)至終濃度；槲皮素：購于美國Sigma公司，用1 mol/L氫氧化鈉配成200 mmol/L的原液；白藜蘆醇：購于美國Sigma公司，用DMSO分別配制成200 mmol/L的原液；銀杏葉提取物：購于美國Sigma公司，用DMSO分別配制成30 mmol/L的原液。人參皂苷：購于中國標準藥品研究院公司，用配成10 mmol/L的原液；茶多酚：購于中國標準藥品研究院，用水配成40 g/mL的原液；山茶花提取物、蒺藜提取物、天麻提取物：購于中國標準藥品研究院，用DMSO配成100 g/L的原液；枸杞提取物購于中國標準藥品研究院公司，用水配成100 g/L的原液。各藥液均4℃保存，臨用時用新鮮培養(yǎng)液配制終濃度。

1.1.3 試劑 F12液，雙抗，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Gibco公司），噻唑藍（MTT，美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），DAFC抗體（美國Sigma公司），左旋多巴（L-DOPA，美國 Sigma公司），Triton X-100（美國Genview公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 鼠永生化黑素細胞B10BR細胞用含10%FBS、igma 1%雙抗的F12培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至融合狀態(tài)，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，傳代。

1.2.2 MTT法測黑素細胞活性 調(diào)整細胞為1×104個/孔，接種于96孔板，每孔150 μL。培養(yǎng)24 h后每孔加入藥液100 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔；空白對照組僅加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后每孔加250 μmol/L H2O2100 μL，加 H2O2孵育 24 h，分別在顯微鏡下觀察細胞變化并拍照保存。然后同上加MTT用酶標儀測定吸光度值（A490值）。

1.2.3 流式細胞儀測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平 調(diào)整細胞為1×105個/孔，接種于12孔板，每孔1 mL。同上依次加藥液和H2O2。然后棄原液，胰酶消化，加培養(yǎng)液中和，液體移入EP管4000 r/min離心3 min，棄上清，每管加PBS 800 μL除去空白管，每管加DAFC 抗體 0.2 μL，37℃溫育 30 min，流式細胞儀測ROS。

1.2.4 多巴氧化法測酪氨酸酶活性 調(diào)整細胞為1×104個/孔，接種于 96 孔板，每孔 150 μL。同上依次加藥和H2O2，24 h后PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X100/PBS溶液50 μL，立即放入-80℃冷凍30 min，室溫融化裂解細胞2 h，每孔加1%L-DOPA 37℃孵育3～4 h，置酶標儀讀值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較用t檢驗，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物作用濃度篩選結(jié)果 經(jīng)100,150,200,250,500 μmol/L H2O2處理24 h后，酶標儀下讀A值顯著降低，黑素細胞活性均下降，其中250 μmol/L H2O2細胞活性下降至對照組的50%～60%。不同濃度的藥物處理黑素細胞后檢測細胞活性，結(jié)果8 g/L枸杞多糖；200 mg/L山茶花提取物；200 mg/L茶多 酚；40 μmol/L 槲皮素；0.3 μmol/L 白藜蘆醇；20 μmol/L銀杏葉提取物；0.2 g/L蒺藜提取物；0.8 g/L天麻提取物；50 μmol/L人參皂苷的藥物處理細胞后，細胞活性不低于對照組，無細胞毒性。選這些濃度用于處理保護細胞（濃度篩選原則是與只加培養(yǎng)液的0濃度組相比，細胞活性無明顯降低，且藥物濃度相對較高）。見圖1。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和數(shù)量，可見H2O2處理后細胞樹突縮短或消失，貼壁細胞數(shù)量減少，但以250 μmol/L H2O2最明顯；經(jīng)特定濃度的上述藥物預(yù)處理細胞后，存活的細胞數(shù)目較多，樹突無明顯回縮。因此初步選取250 μmol/L H2O2及上述濃度的9種植物提取物進行后續(xù)抗氧化試驗。

2.2 藥物預(yù)處理對H2O2損傷細胞的保護作用 250μmol H2O2處理細胞 24 h后，MTT 法測得（0.737±0.032）顯著低于于空白對照組（t=16.869，P<0.01），黑素細胞活性降低；而經(jīng)9種植物提取物預(yù)處理細胞24 h，其A值升高，均能增強細胞活性（P<0.01），見圖2，其中尤以槲皮素（A值 1.290±0.015，t=17.483）、枸杞多糖（1.236±0.005，t=17.938）、蒺藜提取物（1.235±0.004，t=18.003）最顯著。

圖1 不同藥物濃度作用細胞活性的改變

圖2 不同藥物對H2O2損傷后細胞活性影響

圖3 不同藥物對細胞內(nèi)活性氧水平的影響

2.3 藥物對細胞內(nèi)ROS含量的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：單獨H2O2組細胞內(nèi)ROS含量（261.467±3.164，t=25.075）比空白對照組顯著升高（P<0.01），而經(jīng)茶多酚（34.277±0.600，t=60.841）、槲皮素（77.396±1.595，t=53.287）、銀杏葉（128.196±4.063，t=40.569）等植物提取物預(yù)處理后，ROS含量均不同程度地降低，與H2O2組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖 3。

2.4 H2O2及藥物對酪氨酸酶活性影響 經(jīng)250 μmol/L H2O2處理后，黑素細胞的酪氨酸酶活性（A值0.623±0.008，t=7.056）與空白組相比顯著下降（P<0.01），而經(jīng)8 g/L枸杞提取物、0.2 g/L蒺藜提取物、1 g/L 天麻提取物、200 mg/L 茶多酚、40 μmol/L槲皮素預(yù)處理24 h后，黑素細胞的酪氨酸酶活性可明顯提高（P<0.01）。其中以枸杞多糖（A值0.774±0.022，t=6.377）、蒺藜提取物（A值 0.831±0.011，t＝15.470）作用最強。見表1。

3 討論

關(guān)于白癜風(fēng)的發(fā)病機制眾多繁雜，近年來氧化應(yīng)激學(xué)說成為一個研究焦點。氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致白癜風(fēng)的機制主要是局部微環(huán)境中活性氧如H2O2可以通過損傷細胞核和線粒體導(dǎo)致黑素細胞的凋亡，同時活性氧也可能影響酪氨酸酶活性導(dǎo)致黑素合成的障礙和減少。過多的活性氧會造成嚴重的細胞損害，導(dǎo)致凋亡，細胞的凋亡碎片具有很強的免疫原性，可誘發(fā)或加重自身免疫反應(yīng)[7]。Cayio-Andre[8]研究發(fā)現(xiàn)H2O2可引起黑素細胞的樹狀突回縮，H2O2也可引起白癜風(fēng)色素自體重建表皮的黑素細胞分離和經(jīng)表皮消失。這表明白癜風(fēng)患者存在氧化應(yīng)激失衡，且與H2O2關(guān)系密切。同時H2O2增加可引起表皮中酪氨酸酶活性降低，導(dǎo)致黑素合成減少[9]，并對黑素細胞及角質(zhì)形成細胞具有直接損傷作用[10]。

表1 藥物對酪氨酸酶活性的影響 （±s）

表1 藥物對酪氨酸酶活性的影響 （±s）

注：** 各組與 H2O2組比較，**P<0.01，n=4。

組別 濃度 A值 P H2O2 250 μmol/L 0.623±0.008空白 0.730±0.013** 0.002枸杞+H2O2 8 g/L 0.774±0.022** 0.003銀杏葉+H2O2 2.5 μmol/L 0.609±0.061 0.823山茶花+H2O2 100 mg/L 0.572±0.049 0.354蒺藜+H2O2 0.2 g/L 0.831±0.011** 0.000天麻+H2O2 0.8 g/L 0.746±0.011** 0.001茶多酚+H2O2 200 mg/L 0.645±0.021 0.372槲皮素+H2O2 33.3 μmol/L 0.726±0.018** 0.006白藜蘆醇+H2O2 0.3 μmol/L 0.613±0.047 0.839人參皂苷 rg2+H2O2 50 μmol/L 0.674±0.057 0.428

大量的實驗研究證實包括此9種藥物在內(nèi)的多種植物提取物具有抗氧化作用[11]。植物提取物治療白癜風(fēng)歷史悠久，療效確切，用藥安全。之前有學(xué)者已揭示槲皮素、白藜蘆醇等藥物具有顯著的對抗H2O2介導(dǎo)的氧化損傷作用[12-13]。樊均明等[14]應(yīng)用MAC亞溶破模型，探討了人參皂苷可通過抑制足細胞的細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生,降低p38蛋白磷酸化水平而抑制細胞凋亡。Jimenez-Cervantes等[15]采用H2O2處理小鼠及人黑素瘤細胞，發(fā)現(xiàn)H2O2可以降低黑素合成酶的活性，從而抑制黑素的合成。Nagata等[16]的體外實驗結(jié)果顯示槲皮素可增強人黑素細胞活性和酪氨酸酶活性。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理細胞后，細胞活性、酪氨酸酶活性均顯著下降，而ROS含量顯著升高；但經(jīng)特定濃度的9種植物提取物預(yù)處理細胞后均能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞活性降低，并可以有效降低細胞內(nèi)ROS含量，其中8 g/L枸杞、0.8 g/L天麻、0.2 g/L蒺藜、40 μmol/L槲皮素又能增強酪氨酸酶活性，與已報道的研究基本一致。

提示這些可能是其治療白癜風(fēng)的部分機制。但與既往研究相比，本實驗對多種植物提取物的抗氧化活性進行了平行對比，植物提取物達9種，比同類研究種類更多、更為完備，以上研究結(jié)果可能為今后尋找篩選具有抗氧化活性治療白癲風(fēng)的植物提取物，并檢測其對黑素細胞生物學(xué)活性的影響提供了依據(jù)和參考。

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