董 剛 樂 軍 周 輝 項 東 杭州市中醫(yī)院骨傷科 杭州310007

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種最普遍的關(guān)節(jié)疾病，它所帶來的疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，目前仍缺乏有效的治療措施。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）因能降解幾乎所有的軟骨細胞外基質(zhì)而被認為在OA 發(fā)病過程中起重要作用，是降解細胞外基質(zhì)的主要酶系，而核因子-κB（NF-κB）則是介導(dǎo)OA 軟骨中各種不利因素對MMPs 基因表達調(diào)控的最重要的轉(zhuǎn)錄因子。近年研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）能夠明顯抑制實驗?zāi)Ｐ椭蠳F-κB的激活，阻斷其下游靶基因的表達，發(fā)揮對組織器官良好的保護作用，展示了PDTC 機體應(yīng)用的良好前景。本實驗旨在觀察PDTC 關(guān)節(jié)腔注射對兔創(chuàng)傷性O(shè)A 軟骨組織MMP-1、MMP-9mRNA 表達及NF-κB 激活的影響，探討PDTC 機體應(yīng)用預(yù)防、延緩創(chuàng)傷性O(shè)A 進展的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PDTC（美國Sigma 公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶Rtase，dNTP，RNA 酶抑制劑，Taq 酶，隨機寡核苷酸引物（日本TaKaRa 公司）；PCR Marker（美國Fermentas 公司）；NF-κBp65 免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 分組造模與處理 健康6月齡純種新西蘭大白兔20 只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量2.4～2.8kg。3%戊巴比妥鈉麻醉，兩組行右膝橫斷前交叉韌帶術(shù)（ACLT），并行抽屜實驗確認，術(shù)后4天肌注青霉素40 萬U/（kg·d）預(yù)防感染，術(shù)后1 周隨機分為對照組和PDTC 組，各10 只。PDTC 組關(guān)節(jié)腔注射PDTC（1mg/mL），1 次2mg，每周2 次，連續(xù)8 周；對照組同一時間點關(guān)節(jié)腔注射等容量生理鹽水。白兔不作固定，分籠飼養(yǎng)，術(shù)后1 周強迫白兔活動30min/d，持續(xù)2 周，末次用藥3天后處死白兔。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察膝關(guān)節(jié)積液、滑膜腫脹情況，并于解剖顯微鏡（10 倍）下觀察股骨內(nèi)髁軟骨退變情況，按以下標(biāo)準(zhǔn)評分：0 分，關(guān)節(jié)面光整，色澤如常；1分，關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2 分，關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損達軟骨表中層；3 分，關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損達軟骨深層；4 分，軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。

1.4 RT-PCR ①引物設(shè)計與合成：檢索NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中兔MMP-1、MMP-9的全長mRNA序列，應(yīng)用primer premier 5.0 軟件設(shè)計MMP-1、MMP-9 和內(nèi)參照β-actin的上下游引物序列，見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。②總RNA 提取：取股骨內(nèi)髁退變區(qū)軟骨組織置于1mL Trizol 液中勻漿，參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，以紫外分光光度計測定A260/A280 比值≥1.8 控制總RNA 純度。③mRNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA 第一鏈：采用20μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，依次加入5×M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，10 mmol dNTP 1.25μL，RNAase 抑制劑1.6μL，Oligdt（50pM）2μL，DEPC 去離子水補至20μL，充分混均后42℃反應(yīng)60 min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min。冰浴10 min，完成cDNA 鏈合成。④PCR 擴增：反應(yīng)體系為50μL，包含cDNA 10μL，10×PCR 緩沖液5μL，10mmol/L dNTP 1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA 聚合酶2U。擴增條件：94℃預(yù)變性5min 后，94℃變性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸1min，反應(yīng)30個循環(huán)，最后一輪72℃延伸5min，4℃保存。擴增產(chǎn)物取18μL目的基因在1.5%瓊脂糖上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并照相，吸光度掃描儀掃描后PCR 條帶用軟件進行定量分析，結(jié)果為基因表達量對β-actin 內(nèi)參的比值，以上結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。

表1 MMP-1、MMP-9、β-actin 引物序列

1.5 免疫組化 4μm 組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2（過氧化氫）室溫孵育10min，微波修復(fù)抗原10min，溫度92℃～98℃，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，鼠抗兔NF-κBp65 血清工作濃度1：100，4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記二抗37℃孵育20min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育20min，DAB（三氨基聯(lián)苯二胺）顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。軟骨切片隨機選取6個高倍鏡視野（400 倍），其中3個位于軟骨表層和中上層，另3個位于軟骨中下層和下層。計算每個視野中胞核、胞質(zhì)陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，NF-κB 活化程度用NF-κBp65 活性系數(shù)表示，即NF-κBp65 胞核陽性百分率與胞質(zhì)陽性百分率的比值。每張切片的細胞計數(shù)分別由兩個獨立的觀察者進行，其評分誤差率控制在5%以內(nèi)，取兩者均值為最后數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 兩組多數(shù)樣本可見滑膜炎表現(xiàn)，軟骨退變主要位于股骨內(nèi)髁內(nèi)側(cè)。對照組軟骨膜、軟骨出現(xiàn)糜爛缺損，有潰瘍形成，甚至可見軟骨下骨；PDTC 組關(guān)節(jié)面色澤灰暗，軟骨膜、軟骨出現(xiàn)糜爛缺損。PDTC 組軟骨退變明顯輕于對照組（P＜0.05）。兩組形態(tài)學(xué)評分見表2。

表2 兩組形態(tài)學(xué)評分比較 只

2.2 兩組軟骨MMP-1、MMP-9mRNA 表達 MMP-1、MMP-9、β-actin的RT-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1（封二），PDTC 組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量均低于對照組（P＜0.01），見表3。

2.3 軟骨NF-κBp65 蛋白表達 NF-κBp65 免疫組化，NF-κBp65 陽性細胞胞質(zhì)或（和）胞核均呈棕黃色顆粒，陰性對照僅見背景著色，對照組軟骨四層均陽性胞核強烈表達，PDTC 組陽性胞核在軟骨四層中亦散在表達，但表層、中上層表達更為明顯，見圖2（封二）。PDTC 組NF-κBp65 活性系數(shù)明顯低于對照組（P＜0.01），見表3。

圖1 MMP-1、MMP-9、β-actin 電泳圖。

圖2 軟骨NF-κBp65 表達，DAB 染色×400

表3 兩組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量及NF-κBp65 活性系數(shù)比較（）

表3 兩組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量及NF-κBp65 活性系數(shù)比較（）

注：與對照組比較，△P＜0.01

3 討論

3.1 MMP-1、MMP-9 及NF-κB 信號通路在OA 軟骨組織的表達 MMP-1 是OA 發(fā)病機制中極其重要的膠原酶，其作用底物主要是I、II、III 型膠原和蛋白多糖，MMP-1 是OA 軟骨中表達水平最高的膠原酶，這樣在對II 型膠原的降解中MMP-1 表達量上的絕對優(yōu)勢彌補了其相對于其他膠原酶的低效率，使MMP-1 在啟動OA 軟骨基質(zhì)II 型膠原降解，影響II型膠原降解速率方面起到了主導(dǎo)性作用[1]。MMP-9是明膠酶中的一個重要元素，可將膠原酶變性裂解的II 型膠原進一步裂解，并對IV、V、VII 型膠原、明膠等小分子基質(zhì)成分有降解作用。Li 等[2]通過對109例OA 患者的血生化檢測證實，OA 患者血清MMP-9表達水平明顯升高，且其敏感性、特異性較高，因此在OA 早期階段影像學(xué)不足以反映軟骨退變的情況下，通過對血清MMP-9 表達水平的檢測可對OA 進展作出病理學(xué)預(yù)測。NF-κB 則是OA 軟骨中重要的轉(zhuǎn)錄因子，以p50/p65 異二聚體為主要存在形式，當(dāng)細胞受到IL-1β 等細胞因子刺激時，滯留于胞漿中的p50、p65 亞基在入核引導(dǎo)序列的作用下進入胞核內(nèi)，與靶基因增強子順式元件κB 序列結(jié)合，啟動靶基因的表達，目前的研究已經(jīng)證實在細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細胞以及OA 軟骨細胞中存在NF-κB 系統(tǒng)的過量激活[3]。因此以NF-κB 為靶點，抑制NF-κB激活的治療策略受到越來越多學(xué)者的關(guān)注[4]。

3.2 軟骨組織NF-κB 信號通路與MMP-1、MMP-9基因表達的關(guān)系 MMP-1、MMP-9的基因啟動子區(qū)域包含典型的NF-κB 結(jié)合位點，NF-κB的激活對于它們的轉(zhuǎn)錄可能是必需的。Toegel 等[5]在研究蘇木提取物對IL-1β 誘導(dǎo)培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用時，發(fā)現(xiàn)其不僅能夠明顯抑制軟骨細胞中NF-kB 啟動子的激活，而且明顯抑制軟骨細胞中MMP-1、MMP-9mRNA 表達，這在一定程度上說明了在人關(guān)節(jié)軟骨細胞中NF-kB 可能是MMP-1、MMP-9 基因的上游轉(zhuǎn)錄因子。Lu 等[6]研究同樣顯示在細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨肉瘤細胞中，NF-κB 信號通路可能直接或間接的參與了對MMP-1、MMP-9 基因表達的調(diào)控。而本實驗發(fā)現(xiàn)PDTC 關(guān)節(jié)腔注射能夠明顯抑制OA軟骨中NF-κB的激活以及MMP-1、MMP-9 mRNA的表達，一定程度上說明在OA 軟骨中NF-κB 激活直接或間接參與對MMP-1、MMP-9 基因表達的調(diào)控。

3.3 PDTC 機體應(yīng)用的可行性 PDTC 是一種抗氧化劑，主要作用于IκB 降解的上游環(huán)節(jié)（IκBα 磷酸化或IKK 活性水平），是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的特異性抑制劑。通過抑制NF-κB 活性來抑制下游相關(guān)基因的表達已成為近年來的研究熱點。如急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征時伴隨著肺組織中NF-κB的過量激活，以及腫瘤壞死因子（TNF-α）、胞間黏附分子1（ICAM-1）等炎性細胞因子的大量釋放，進而導(dǎo)致肺炎性損傷、肺功能下降[7]。而應(yīng)用PDTC 靜脈注射干預(yù)急性肺損傷模型后，能夠明顯抑制NF-κB的激活，以及反映肺損傷程度的TNF-α 等炎性細胞因子的過量表達，從而有效改善肺功能[8]。而本實驗顯示，PDTC 組軟骨組織MMP-1、MMP-9mRNA 表達水平明顯低于對照組（P＜0.01），PDTC 組軟骨退變明顯輕于對照組（P＜0.05）。PDTC 在動物模型研究中的良好效果，可能與PDTC 能夠選擇性地抑制NF-κB 激活，抑制炎性細胞因子等NF-κB 下游基因的表達有關(guān)，而目前的動物模型實驗中未見PDTC 干預(yù)對動物模型毒性的報道，展示了PDTC 機體干預(yù)應(yīng)用的良好前景。

本實驗通過對創(chuàng)傷性兔OA 模型行關(guān)節(jié)腔注射PDTC，發(fā)現(xiàn)PDTC 能夠明顯抑制OA 軟骨中NF-κB信號通路的激活以及MMP-1、MMP-9mRNA 表達，一定程度上減緩、抑制OA 軟骨退變的進程，為OA治療提供了新的臨床靶標(biāo)。鑒于PDTC 是NF-κB 特異性抑制劑，對MMP-1、MMP-9 基因表達無直接性抑制作用，筆者認為NF-κB的過量激活參與了OA病程的發(fā)展，而PDTC 對MMP-1、MMP-9 基因表達的抑制作用正是通過抑制NF-κB的激活而實現(xiàn)，提示在OA 軟骨中NF-κB的激活，直接或間接地參與了對MMP-1、MMP-9 基因表達的調(diào)控。

［1］Elliott S，Hays E，Mayor M，et al.The triterpenoid CDDO inhibits expression of matrix metalloproteinase -1，matrix metalloproteinase-13 and Bcl-3 in primary human chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2003，5（5）：R285-291.

［2］Li H，Li L，Min J，et al.Levels of metalloproteinase（MMP-3，MMP-9），NF-kappaB ligand（RANKL），and nitric oxide（NO）in peripheral blood of osteoarthritis（OA）patients［J］.Clin Lab，2012，58（7-8）：755-762.

［3］Campo GM，Avenoso A，D'Ascola A，et al.Hyaluronan in part mediates IL-1beta-induced inflammation in mouse chondrocytes by up-regulating CD44 receptors［J］.Gene，2012，494（1）：24-35.

［4］Sunaga T，Oh N，Hosoya K，et al.Inhibitory effects of pentosan polysulfate sodium on MAP-kinase pathway and NFκB nuclear translocation in canine chondrocytes in vitro［J］.J Vet Med Sci，2012，74（6）：707-711.

［5］Toegel S，Wu SQ，Otero M，et al.Caesalpinia sappan extract inhibits IL1β-mediated overexpression of matrix metalloproteinases in human chondrocytes［J］.Genes Nutr，2012，7（2）：307-318.

［6］Lu YC，Jayakumar T，Duann YF，et al.Chondroprotective role of sesamol by inhibiting MMPs expression via retaining NF-κB signaling in activated SW1353 cells［J］.J Agric Food Chem，2011，59（9）：4969-4978.

［7］You Z，F(xiàn)eng D，Xu H，et al.Nuclear factor-kappa B mediates one-lung ventilation-induced acute lung injury in rabbits［J］.J Invest Surg，2012，25（2）：78-85.

［8］Wang M，Liu T，Wang D，et al.Therapeutic effects of pyrrolidine dithiocarbamate on acute lung injury in rabbits［J］.J Transl Med，2011，13（9）:61.