蔡欣蕊 錢(qián)衛(wèi)斌 錢(qián)秋海 郭春芳 姜群群

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)博士研究生，山東 濟(jì)南 250014)

實(shí)驗(yàn)研究

糖脈通對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素mRNA表達(dá)的影響※

蔡欣蕊 錢(qián)衛(wèi)斌1錢(qián)秋海△郭春芳2姜群群3

(山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)博士研究生，山東 濟(jì)南 250014)

【摘 要】目的觀察中藥組方糖脈通對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素(Obestatin) mRNA表達(dá)的影響并探討其機(jī)制。方法將60只雄性SD大鼠用鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂飲食制造糖尿病模型大鼠，選取40只隨機(jī)分為模型對(duì)照組、西藥對(duì)照組、糖脈通小劑量組、糖脈通大劑量組4組，每組各10只；另取10只正常大鼠為空白對(duì)照組。模型對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃給藥；糖脈通小劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，以生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥；糖脈通大劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，以生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥；西藥對(duì)照組在格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，以濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃給藥；空白對(duì)照組以等容積蒸餾水灌胃。除空白對(duì)照組外均給予高糖高脂飼料。藥物干預(yù)12周后，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)各組大鼠血管組織Obestatin mRNA的表達(dá)。結(jié)果模型對(duì)照組、西藥對(duì)照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；糖脈通大、小劑量組及西藥對(duì)照組血管組織中Obestatin mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組減少(P<0.05)，且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論糖脈通可能通過(guò)降低Obestatin mRNA在模型大鼠血管組織中的異常表達(dá)，對(duì)血管功能起到保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】糖脈通；糖尿病血管病變；高脂血癥；疾病模型，動(dòng)物；胃促生長(zhǎng)素；RNA，信使；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

糖尿病下肢動(dòng)脈血管病變(lower-extremity arterial disease，LEAD)是指糖尿病患者出現(xiàn)下肢動(dòng)脈粥樣硬化及微血管病變?yōu)橹饕±砀淖?，以肢端疼痛、間歇性跛行、潰瘍、壞疽為主要臨床表現(xiàn)，是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一。肥胖抑制素(Obestatin)是從大鼠胃組織中分離的一種生長(zhǎng)素(Ghrelin)相關(guān)肽，可以結(jié)合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，產(chǎn)生與Ghrelin相反的作用，具有非常廣泛的生物學(xué)功能。本研究通過(guò)觀察糖脈通對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)方面來(lái)驗(yàn)證其療效，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20) g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXR(魯)2009015]。普通動(dòng)物飼料由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高糖高脂飼料(清潔級(jí))由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(配方：10.0%豬油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料)。

1.1.2 藥物及試劑 糖脈通藥物組成：黃芪30 g，黃精30 g，桑枝15 g，地龍9 g，水蛭15 g，大血藤15 g，土茯苓30 g。實(shí)驗(yàn)時(shí)制成糖脈通濃縮煎劑，分別為2、4 g/mL。西洛他唑片(100 mg/片，浙江大冢制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10960014)，格列齊特片(80 mg/片，南京瑞爾醫(yī)藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20003361)。鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，北京博愛(ài)港商貿(mào)有限公司提供。超純RNA提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；DL2000 DNA Marker，日本TAKARA公司；氯仿分析純，異丙醇，無(wú)水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)水等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 普通高速離心機(jī)(5415D型，Eppendorf公司)；PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國(guó)PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 電泳儀及電泳槽(北京東方恒偉科技開(kāi)發(fā)公司)；美國(guó)強(qiáng)生穩(wěn)豪全自動(dòng)血糖儀；移液器(Gilson 產(chǎn)品)，Axygen無(wú)RNA酶槍頭及eppendorf管等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 取健康SD雄性大鼠50只，以普通動(dòng)物飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。最后一次喂食后禁食12 h，斷尾取靜脈血測(cè)空腹血糖。然后用0.1 mmol/L無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液(4 ℃，pH值=4.2)配置濃度為2%的STZ溶液，按30 mg/kg左下腹腔單次注射STZ，制造糖尿病(DM)模型。72 h后斷尾取靜脈血測(cè)空腹血糖，選空腹血糖≥16.7 mmol/L的動(dòng)物作為STZ糖尿病大鼠模型，選取40只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及給藥 將40只成模大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。①模型對(duì)照組：0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃；②糖脈通小劑量組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，給予生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃；③糖脈通大劑量組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，給予生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃；④西藥對(duì)照組：在用格列齊特20 mg/kg的基礎(chǔ)上，給予濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃。另取10只正常大鼠，普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射等量無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液，血糖均在4.7～7.3 mmol/L，選為空白對(duì)照組，給予等容積蒸餾水灌胃。室溫18～20 ℃，相對(duì)濕度69%，12 h交替照明，大鼠自由飲水，除空白對(duì)照組外其余各組大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥觀察12周。

1.2.3 組織標(biāo)本的采集 給藥觀察12周后，斷尾取靜脈血檢測(cè)各組動(dòng)物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)腹于脊柱旁剖離腹主動(dòng)脈并截取，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后，放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)。

1.2.4.1 總RNA提取 按超純RNA提取試劑盒(CW0581)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。100 mg組織標(biāo)本經(jīng)液氮研磨，加入1 mL Buffer RLT，室溫放置5 min，讓組織完全裂解。加200 μL氯仿，充分劇烈震蕩 15 s，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管內(nèi)，加等量的無(wú)水乙醇，混勻，將混合物加到離心柱上，12 000 r/min離心30 s，加異丙醇 1 700 μL，分別12 000 r/min離心30 s，加異丙醇2 500 μL 2次，12 000 r/min離心30 s，14 000 r/min離心2 min，加預(yù)熱的DEPC水50 μL，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心30 s，收集RNA。

1.2.4.2 RT-PCR 反應(yīng)檢測(cè)Obestatin mRNA表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄：5×BT buffer 2 μL

Primer Mix 0.5 μL

Enzyme Mix 0.5 μL

RNA 1 μg

DEPC-H2O 補(bǔ)足10 μL

逆轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，

PCR： 2×PCR mix 10 μL

10 μmol/L Obestatin上游引物 0.4 μL

10 μmol/L Obestatin下游引物 0.4 μL

10 μmol/L β-actin上游引物 0.2 μL

10 μmol/L β-actin下游引物 0.2 μL

RT產(chǎn)物 4 μL

DEPC H2O 補(bǔ)足20 μL

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。

大鼠β-actin上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

擴(kuò)增產(chǎn)物：481 bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’-CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

擴(kuò)增產(chǎn)物：113 bp

1.2.4.3 電泳及數(shù)據(jù)分析 1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染料。Alpha imager觀察電泳條帶存入圖象，β-actin的產(chǎn)物為481 bp，Obestatin的產(chǎn)物為113 bp。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY 軟件分別測(cè)量?jī)?nèi)參照和Obestatin基因擴(kuò)增條帶的密度，以O(shè)bestatin條帶的密度與內(nèi)參照管家基因β-actin的密度比值代表基因表達(dá)的相對(duì)水平。

2 結(jié) 果

糖脈通對(duì)模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表1。

表1 糖脈通對(duì)模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達(dá)的影響 ±s

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型對(duì)照組比較，△P<0.05 ;與西藥對(duì)照組比較，#P<0.05

由表1可見(jiàn)，模型對(duì)照組、西藥對(duì)照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；糖脈通大、小劑量組及西藥對(duì)照組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組減少(P<0.05)，且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對(duì)照組(P<0.05)。(見(jiàn)封3，圖1)。

3 討 論

LEAD屬于糖尿病動(dòng)脈硬化性疾病，又稱周圍血管病變，是糖尿病最常見(jiàn)的慢性血管并發(fā)癥之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管的基本結(jié)構(gòu)，參與血管內(nèi)外物質(zhì)交換和血管新生等，具有重要生理作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷常常是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、糖尿病血管并發(fā)癥和高血壓等疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，并貫穿疾病發(fā)展的整個(gè)過(guò)程[1]。因此，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)已成為治療糖尿病大血管病變研究的重要方向。

某些生長(zhǎng)因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常代謝及維持血管的基本結(jié)構(gòu)起著重要的作用。Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌激素受體的內(nèi)源性配體，它是由28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子短肽[2]，傳統(tǒng)認(rèn)為其對(duì)食欲及糖、脂的合成代謝有重要的作用。近來(lái)有研究表明，Ghrelin還可降低血管的炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞核因子(NF)-κB的激活來(lái)抑制促炎癥的趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)，從而抑制早期AS的發(fā)生[3]。Obestatin是2005年從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關(guān)肽，它可以結(jié)合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，產(chǎn)生與Ghrelin相反的作用[4]。Obestatin亦具有非常廣泛的生物學(xué)功能，除負(fù)向調(diào)節(jié)攝食和胃腸運(yùn)動(dòng)外[4]，也可作用于胰腺胰島組織抑制胰島素、胰多肽、生長(zhǎng)抑素等的分泌[5]。另有研究表明Obestatin與各種糖、脂代謝因素密切相關(guān)[6]。鑒于對(duì)心血管尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，Ghrelin與Obestatin已逐漸成為糖尿病大血管病變的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察糖脈通對(duì)糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示模型大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Obestatin mRNA的表達(dá)明顯升高，而糖脈通可顯著抑制Obestatin mRNA在血管內(nèi)皮的異常表達(dá)，效果優(yōu)于西藥對(duì)照組。提示糖脈通可能通過(guò)抑制Obestatin mRNA在血管內(nèi)皮的異常表達(dá)起到保護(hù)血管內(nèi)皮、延緩血管病變病程的作用。

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EffectofTangmaitongonmRNAexpressionofObestatinininthevasculartissueofdiabeticratsmodel

CAIXinrui*,QIANWeibin,QIANQiuhai,etal.

*2012Doctor-postgraduate,TheFirstClinicalMedicalCollegeofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineShandong,Jinan250014

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanisms of Tangmaitong on mRNA expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model.Method Rat diabetic model were made with STZ and high-quality and high-carbohydrate diet.40 diabetic model rats were randomly divided into four groups,model group,western medicine group,high-and low-dose Tangmaitong group.10 normal rats were as control group.Model group received 0.9% NaCl solution,high-and low-dose Tangmaitong groups received 10mL/kg(2 g/mL,4 g/mL crude drug) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Rat in western medicine group received 10 mL/kg(Cilostazol suspension 1.8 mg/mL) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Control group received equal volume of distilled water.After 12 weeks of drug intervention,rats were killed,the vascular were removed and the mRNA expression of Obestatin in the vascular was observed by the method of RT-PCR.ResultsThe mRNA expression of Obestatin was significantly increased,and Tangmai-tong could lower the mRNA expression of Obestatin in the vascular in a dose-dependent manner.The decrease of the mRNA expression of Obestatin in high-and low-dose Tangmaitong group was superior to that in western medicine group(P<0.05).ConclusionTangmaitong can play a protective effect on vascular function by reducing the abnormal expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model,and deserves further research.

【Key words】Tangmaitong; Diabetic angiopathies; Hyperlipemia; Disease model; Animal; Ghrelin; RNA; Messenger; RT-PCR

【中圖分類號(hào)】R587.230.531；R589.210.531；R342.22

A

1002-2619(2013)12-1868-03

※ 項(xiàng)目來(lái)源：山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2010GSF10242)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2009Z004)

山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250011

1 日本鳥(niǎo)取大學(xué)醫(yī)學(xué)部，日本 鳥(niǎo)取 683-8503

2 山東省禹城市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 禹城 251200

3 中國(guó)人民解放軍第一○七醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 煙臺(tái) 264000

蔡欣蕊(1985—)，女，博士研究生在讀，碩士。研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)。

2013-06-17)