邱奕 趙善民 師長宏 史皆然

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）所引起的一種慢性傳染病，絕大部分以呼吸系統(tǒng)感染為主。據(jù)估計(jì)全世界約有1／3人口感染了Mtb，其中，10%的人會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性TB，而大部分以潛伏感染形式存在［1］。疫苗用于傳染病的預(yù)防可以達(dá)到事半功倍的效果，卡介苗（BCG）是目前惟一用于預(yù)防TB的疫苗，但其存在保護(hù)期短、免疫應(yīng)答較弱及對(duì)潛伏感染者無效等問題，因此急需開發(fā)新型疫苗。結(jié)核疫苗根據(jù)用途可分為兩類：一是預(yù)防性疫苗，主要應(yīng)用于新生兒和未感染的正常人群，保護(hù)其不被Mtb感染。二是治療性疫苗，主要應(yīng)用于己感染Mtb的無癥狀攜帶者，使其不發(fā)病；或用于已經(jīng)發(fā)病的患者，促進(jìn)其早日痊愈［2］。

復(fù)蘇促生長因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）功能類似于真核生物的生長因子［3］，由藤黃微球菌（Micrococcus luteus，M．luteus）分泌，可以促進(jìn)休眠菌復(fù)蘇和生長。GenBank數(shù)據(jù)庫中查詢到34個(gè)與Rpf同源性較高的蛋白質(zhì)信息，在Mtb H37Rv株和牛分枝桿菌基因組中，5個(gè)基因與M．luteus菌Rpf蛋白編碼基因同源，分別為Rv0867C（Rpf A）、Rv1009C（Rpf B）、Rv1884C（Rpf C）、Rv2389C（RpfD）和Rv2450C（RpfE），推測(cè)這些基因編碼的蛋白也具有與Rpf相類似的生物學(xué)活性——促細(xì)菌生長作用［4-5］。這些基因編碼蛋白稱為Rpf樣蛋白。

本實(shí)驗(yàn)室前期制備了Rpf蛋白、Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及Rpf結(jié)構(gòu)域突變體蛋白，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的Rpf蛋白、Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白具有復(fù)蘇休眠菌的功能，而Rpf結(jié)構(gòu)域突變體蛋白則具有拮抗復(fù)蘇休眠菌的功能［6］。為此，筆者從2011年11月到2012年2月，進(jìn)一步觀察原核表達(dá)的Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及Rpf結(jié)構(gòu)域突變體蛋白刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體及IFN-γ／IL-2水平，以評(píng)價(jià)該系列蛋白作為疫苗的免疫原性及其對(duì)感染Mtb小鼠的免疫保護(hù)效力，以期為TB新型疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［7］。

材料和方法

一、材料和試劑

6～8周齡雄性SPF級(jí)BALB／c小鼠70只由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。表達(dá)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白包涵體的重組質(zhì)粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2為本實(shí)驗(yàn)室前期制備［6］。Mtb的H37Rv株由陜西省結(jié)核病防治研究所王瑞惠贈(zèng)。7H9液體培養(yǎng)基和7H10固體培養(yǎng)基（美國DIFCO公司）。分枝桿菌培養(yǎng)增強(qiáng)劑ADC和OADC（德國Beckton Dickinson公司）。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。小鼠IFN-γELISA試劑盒、小鼠IL-2ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。P0009BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。96孔酶標(biāo)板（杭州維特潔生化技術(shù)有限公司）。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

二、方法

1．Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及其突變體蛋白的純化與鑒定：采用親和色譜法純化目的蛋白并用Rpfd的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定，證實(shí)表達(dá)的融合蛋白具有生物活性［6］。

2．蛋白濃度測(cè)定：根據(jù)二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白（5mg／ml胎牛血清蛋白）濃度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品A562值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：y＝789．08x2＋1243．4x-163．75（R2＝0．9951，y代表待測(cè)蛋白濃度，x代表待測(cè)蛋白A562值），并計(jì)算出每種待測(cè)蛋白濃度。

3．待測(cè)抗原Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白的濃度：1．400mg／ml、2．438mg／ml、3．882mg／ml（圖1）。

圖1 562nm波長下測(cè)定吸光度A值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4．免疫小鼠：將70只小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組14只。Rpfd免疫組（A組）、Rpfd1免疫組（A1組）、Rpfd2免疫組（A2組）、BCG免疫組（B組）和生理鹽水組（C組）。每只小鼠采用腹部皮下多點(diǎn)注射分別含有50μg蛋白（Rpfd、Rpfd1、Rpfd2）的200μl生理鹽水，間隔2周免疫1次，共3次；B組采用腹部皮下多點(diǎn)注射含有BCG 1×105CFU的200μl生理鹽水，C組注射200μl生理鹽水。末次免疫后4周，采用尾靜脈注射的方式，用劑量為1×105CFU的毒株H37Rv攻擊各組小鼠。

5．免疫小鼠血清抗體水平檢測(cè)：（1）3種抗原板的包被和封閉：根據(jù)測(cè)得的3種蛋白的濃度，用配制好的0．05mol／L碳酸鹽包被緩沖液（pH 值為9．6），分別將3種蛋白稀釋至終濃度為10μg／ml，包被96孔板所有反應(yīng)孔，每反應(yīng)孔0．1ml，4℃過夜。用洗滌液PBST（pH 值為7．4；組分：NaHPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、0．5%Tween-20）洗滌3次。用含0．5%BSA的PBS（pH值為7．4）液37℃封閉2h。同上洗滌后，-20℃保存?zhèn)溆?。?）ELISA法檢測(cè)免疫小鼠體內(nèi)抗體水平：末次免疫后1周，隨機(jī)選取每組小鼠7只，采用摘眼球法取外周血500×g 20min離心分離血清。用稀釋液（0．1%BSA的PBS，pH值為7．3）將每組血清依次按1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200比例稀釋，分別加入3種蛋白包被的抗原板中，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置稀釋液空白對(duì)照孔、生理鹽水陰性對(duì)照孔和BCG陽性對(duì)照孔，37℃孵育1h。用PBST洗滌3次，用稀釋液將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀釋，37℃孵育1h，再次用PBST洗滌3次，加入鄰苯二胺（OPD）和過氧化氫（H2O2）底物顯色液，37℃顯色10～20min。用2mol／L的H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定450nm處的吸光度。取3孔平均值作為每個(gè)樣本的終結(jié)果。

6．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平檢測(cè)：末次免疫后1周、攻毒后1周，每組取7只小鼠的外周血500×g20min離心分離血清，采用夾心ELISA法檢測(cè)IFN-γ含量。操作步驟按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

7．免疫小鼠感染 Mtb前后血清IL-2水平檢測(cè)：末次免疫后1周，攻毒后1周，每組取7只小鼠的外周血500×g20min離心分離血清，采用夾心ELISA法檢測(cè)IL-2含量。操作步驟按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)確定每組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布（P值均＞0．05），多組的差異性比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．免疫小鼠血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果：免疫小鼠血清特異性抗體含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。A、A1、A2三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清抗體含量差異有統(tǒng)計(jì)意義，具體見表1。

2．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果：感染前后，免疫小鼠血清IFN-γ含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清IFN-γ含量差異有統(tǒng)計(jì)意義，具體見表2。

3．免疫小鼠感染Mtb前后血清IL-2水平檢測(cè)結(jié)果：感染前后，免疫小鼠血清IL-2含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清IL-2含量差異有統(tǒng)計(jì)意義，具體見表3。

討 論

Rpf由M．luteus分泌，在10-12g水平以自分泌和旁分泌形式促進(jìn)休眠菌的復(fù)活和生長。實(shí)驗(yàn)證明，M．luteus Rpf蛋白的A42～L118的77個(gè)氨基酸殘基是高度保守的區(qū)域，稱為Rpf結(jié)構(gòu)域，該Rpf結(jié)構(gòu)域是Rpf發(fā)揮復(fù)蘇作用的核心，M．luteus Rpf蛋白與Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白具有一致的生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，100pmol／L的Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白刺激Mtb H37Ra休眠菌復(fù)蘇和生長作用明顯，這種作用在加入抗Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白的單克隆抗體mAb后被明顯抑制［8-9］，說明封閉這種蛋白可以抑制Mtb的增殖。

表1 免疫小鼠血清中抗體含量（A450值，±s）

表1 免疫小鼠血清中抗體含量（A450值，±s）

注 血清稀釋倍數(shù)為1∶100，試驗(yàn)中對(duì)血清做了不同比例稀釋，各個(gè)比例血清檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，故選擇稀釋比例1∶100血清檢測(cè)結(jié)果作為代表；a：與C組比較；b：與B組比較

組別抗原包被A450值 t值 P值 A450值 t值 P值 A450值 t值 P值Rpfd抗原包被 Rpfd1抗原包被 Rpfd2 A組0．652±0．2120．283b 5．701a＞0．05＜0．05 1．030±0．3045．276b 7．544a＜0．05＜0．05 0．542±0．2400．144b 2．775a＞0．05＝0．05 A1組0．990±0．2724．635b 10．973a＜0．05＜0．05 1．368±0．17117．20b 20．962a＜0．05＜0．05 1．055±0．2028．009b 11．908a＜0．05＜0．05 A2組1．470±0．4556．634b 9．963a＜0．05＜0．05 2．766±0．24531．643b 34．113a＜0．05＜0．05 1．605±0．5448．192b 9．744a＜0．05＜0．05 B組 0．631±0．180 0．573±0．004 0．538±0．100 C組 0．284±0．100 0．370±0．033 0．368±0．006 F值0．020 0．003 0．013 4．846 8．722 5．492 P值

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）檢測(cè)結(jié)果（±s）

注 a：與C組比較；b：與B組比較

感染Mtb H37Rv前感染Mtb H37Rv后組別IFN-γ含量 t值 P值 IFN-γ含量 t值 P值A(chǔ)組553．47±132．003．150b 6．625a＜0．05＜0．05 371．65±78．550．099b 3．110a＞0．05＜0．05 A1組484．85±288．931．089b 3．590a＞0．05＜0．05 492．41±211．742．874b 3．680a＜0．05＜0．05 A2組506．54±378．931．094b 3．840a＞0．05＜0．05 543．09±223．073．150b 6．304a＜0．05＜0．05 B組 385．28±129．07 335．36±207．72 C組 262．19±76．89 260．57±95．47 F值11．002 0．002 10．099 P值0．001

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）檢測(cè)結(jié)果（±s）

注 a：與C組比較；b：與B組比較

組別感染Mtb H37Rv前 感染Mtb H37Rv后IL-2含量 t值 P值 IL-2含量 t值 P值A(chǔ)組1490．05±215．357．763b 11．122a＜0．05＜0．05 806．81±306．394．627b 4．789a＜0．05＜0．05 A1組1738．91±358．407．903b 10．061a＜0．05＜0．05 1373．22±143．7515．900b 17．711a＜0．05＜0．05 A2組2270．74±193．4016．308b 21．680a＜0．05＜0．05 439．03±25．152．024b 2．368a＞0．05＞0．05 B組 718．70±269．29 335．26±176．81 C組 553．56±196．26 339．24±144．41 F值605．634 0．000 301．236 P值0．000

本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)了M．luteus Rpf結(jié)構(gòu)域特異性PCR引物，應(yīng)用基因點(diǎn)突變技術(shù)將M．luteus Rpf基因序列中的第54位谷氨酸（gag）分別突變?yōu)橘嚢彼幔╝ag）和丙氨酸（gcg）得到 Rpfd1、Rpfd2突變體。研究表明：5μg／ml的Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白和Rpf蛋白均可刺激恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M．S）生長，該結(jié)構(gòu)域突變體 Rpfd1、Rpfd2對(duì)于 M．S 的促生長作用不明顯［6］，推測(cè)Rpfd1、Rpfd2既可去除復(fù)蘇休眠M(jìn)tb的功能，又能保留誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體封閉Mtb 5種Rpf樣蛋白，從而抑制了Mtb的復(fù)蘇及生長。

目前研究表明，機(jī)體抗結(jié)核免疫由體液免疫及細(xì)胞免疫構(gòu)成，在Mtb潛伏感染狀態(tài)下，體液免疫發(fā)揮的作用機(jī)制不清。機(jī)體內(nèi)休眠M(jìn)tb分泌的Rpf樣蛋白刺激機(jī)體免疫能力作用很弱，不足以形成抗體。因此，在Mtb潛伏感染狀態(tài)下，無相應(yīng)抗體抑制Rpf樣蛋白對(duì)休眠M(jìn)tb的促復(fù)蘇作用，筆者推測(cè)當(dāng)外源性活躍的Mtb進(jìn)入機(jī)體后，產(chǎn)生的Rpf樣蛋白量急劇增多，可喚醒機(jī)體內(nèi)潛伏感染的休眠M(jìn)tb，促使休眠M(jìn)tb復(fù)蘇，從而導(dǎo)致TB的發(fā)生或是復(fù)發(fā)。BCG對(duì)成人 Mtb保護(hù)作用不強(qiáng)，可能因BCG產(chǎn)生抗Rpf樣蛋白抗體數(shù)量有限，如果能讓機(jī)體產(chǎn)生及保持比BCG刺激所產(chǎn)生的更高濃度抗Rpf樣蛋白的抗體，就有可能封閉無論是外源的、還是自分泌的Rpf樣蛋白的功能，從而達(dá)到抑制休眠M(jìn)tb復(fù)蘇的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效價(jià)的抗Rpfd特異性抗體，且3種抗原刺激產(chǎn)生的抗體效價(jià)顯著高于BCG免疫組。其中A組產(chǎn)生的抗體水平最高，提示其啟動(dòng)感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原，均能被3種抗體識(shí)別，且親合程度趨于一致，說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產(chǎn)生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應(yīng)，提示該3種蛋白產(chǎn)生的特異性抗體有可能同時(shí)封閉Mtb的5種Rpf樣蛋白，從而達(dá)到抑制休眠M(jìn)tb復(fù)蘇和生長的作用。研究中發(fā)現(xiàn)，A組在Rpfd1蛋白作為抗原所產(chǎn)生抗體A450值水平高于B組，在Rpfd、Rpfd2蛋白作為抗原時(shí)產(chǎn)生的抗體A450值水平不高于B組，與預(yù)期設(shè)想不一致，分析可能在小鼠免疫過程中將皮下免疫誤注入腹腔，至免疫效能降低所致。

Mtb是胞內(nèi)寄生菌，特異性免疫以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主［10-11］。IFN-γ是宿主抵御細(xì)胞內(nèi)Mtb具有代表性的Th1型細(xì)胞因子，是機(jī)體抵抗Mtb感染重要的細(xì)胞因子。IFN-γ基因敲除的小鼠對(duì)Mtb的感染高度易感，常規(guī)劑量BCG免疫即可導(dǎo)致其死亡［12］。IL-2能促進(jìn)結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞克隆的增殖活化，促使T細(xì)胞分泌IFN-γ，活化NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺滅Mtb的能力［13］。IL-2或IFN-γ聯(lián)合抗結(jié)核藥物治療難治性肺結(jié)核或耐多藥結(jié)核病，可促使癥狀改善，痰菌陰轉(zhuǎn)，病灶吸收［14-15］。筆者用原核表達(dá)的Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及其突變體蛋白免疫小鼠，分別觀察了同源加強(qiáng)免疫后和H37Rv毒株攻擊后，機(jī)體分泌IFN-γ和IL-2的能力，從細(xì)胞免疫應(yīng)答方面評(píng)價(jià)Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及其突變體蛋白作為疫苗對(duì)感染Mtb小鼠的免疫保護(hù)效力。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，感染前A組小鼠產(chǎn)生的IFN-γ水平高于B組（P＜0．05）和C組（P＜0．05）；感染后A1組、A2組小鼠產(chǎn)生的IFN-γ水平高于B組（P＜0．05）和 C組（P＜0．05）。筆者推測(cè) H37Rv攻擊小鼠后，Rpfd發(fā)揮其促細(xì)菌生長作用，使小鼠體內(nèi)Mtb大量生長，巨噬細(xì)胞吞噬大量Mtb后，崩解死亡致使IFN-γ含量明顯下降；而Rpfd1、Rpfd2無促細(xì)菌生長作用，巨噬細(xì)胞吞噬Mtb后，未達(dá)到細(xì)菌負(fù)荷過載，巨噬細(xì)胞殺滅Mtb，同時(shí)促進(jìn)IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2免疫小鼠后，刺激小鼠產(chǎn)生IL-2水平明顯升高，高于B組；Mtb攻擊免疫小鼠后，三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2檢測(cè)量均有下降，A2組IL-2下降尤為明顯，推測(cè)機(jī)體在抵抗Mtb感染中，IL-2起到十分關(guān)鍵的作用，大量消耗IL-2所致，這與Mtb患者IL-2產(chǎn)生量較正常人減少，重型患者尤為明顯的臨床現(xiàn)象十分吻合。

免疫佐劑是一類非特異性免疫增強(qiáng)劑，與抗原物質(zhì)合并使用時(shí)能增強(qiáng)抗原物質(zhì)免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。研究顯示，免疫佐劑在以體液免疫為主的疾病治療中取得了肯定的效果。也有少數(shù)報(bào)道免疫佐劑可增強(qiáng)結(jié)核病的治療效果。實(shí)際上，在以細(xì)胞免疫為主的疾病中，免疫佐劑的免疫增強(qiáng)效果不及其對(duì)炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)效果［16］，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中未加入免疫佐劑。

以上結(jié)果表明，Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白及其突變體蛋白同時(shí)具有啟動(dòng)宿主體液免疫功能及增強(qiáng)宿主細(xì)胞免疫功能的雙重作用，可能起到預(yù)防Mtb感染的作用，從而保護(hù)新生兒和未感染Mtb的正常人群；并且起到治療作用，使己感染Mtb的無癥狀攜帶者不發(fā)病，或用于已經(jīng)發(fā)病的患者，促進(jìn)其早日痊愈。在下一步實(shí)驗(yàn)中將設(shè)計(jì)構(gòu)建 Mtb Rpf樣蛋白結(jié)構(gòu)域突變體，并建立小鼠潛伏感染模型，觀察其對(duì)休眠M(jìn)tb復(fù)蘇的抑制效果，以期為TB的防治提供更直接的理論和實(shí)踐依據(jù)。

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