劉亞云,李潔,楊伍,蘇柯,楊艷燕

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430062)

0 引言

黃原膠又稱漢生膠,是由野油菜黃單胞菌分泌的一種胞外水溶性多糖.作為一種無(wú)毒性的生物多糖,具有良好的水溶性、增粘性、乳化穩(wěn)定性及對(duì)酸、堿、鹽、反復(fù)凍融的高穩(wěn)定性等特點(diǎn),被廣泛用于食品、醫(yī)藥、日用化工及石油開采等多個(gè)領(lǐng)域,是一種用途廣泛的微生物多糖[1-2].

但黃原膠具有的高穩(wěn)定性是一把雙刃劍,使黃原膠可以廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的同時(shí),也帶來(lái)了一些問題.比如,在石油開采工業(yè)中使用黃原膠作為驅(qū)替劑,可以增加驅(qū)替劑的粘度,提高采油率;但黃原膠的使用也使得采出液的油物性發(fā)生了變化,如原油密度增加,粘度增大,采出液含聚濃度增加,原油乳化狀態(tài)復(fù)雜,增加了污水處理的難度,增加了后續(xù)工藝如油料運(yùn)輸及產(chǎn)品純化成本[3].因此,唯有尋找到有效降解黃原膠的方法,才能使黃原膠更好地應(yīng)用于石油開采業(yè)中[4-5].

本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株從土壤中分離的能降解黃原膠的菌株進(jìn)行了篩選鑒定,包括形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA的序列分析,確定該菌株的菌屬,為進(jìn)一步利用該菌株降解黃原膠的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1供試菌湖北大學(xué)應(yīng)用生化實(shí)驗(yàn)室保存的黃原膠降解菌菌液.

1.2菌株的富集培養(yǎng)取菌液接種至富集培養(yǎng)基,37 ℃、搖速180 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后,吸取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新的富集培養(yǎng)基中,以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h.經(jīng)過多次的富集培養(yǎng),使培養(yǎng)液中可以降解黃原膠的菌株得到富集.在配制的黃原膠富集培養(yǎng)基[6]中添加的黃原膠濃度為5 g/L.

1.3菌株的分離純化吸取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液,稀釋10-4倍后涂布于黃原膠固體培養(yǎng)基,觀察平板上菌株的生長(zhǎng)情況.挑取平板上生長(zhǎng)良好的菌株接入黃原膠選擇性培養(yǎng)基中,37 ℃、搖速180 r/min條件下培養(yǎng)24 h,觀察培養(yǎng)液的粘度變化,制作菌株的生長(zhǎng)曲線.黃原膠固體培養(yǎng)基和黃原膠選擇性培養(yǎng)基參考劉晗等[7]配制.

1.4培養(yǎng)基粘度測(cè)定烏氏粘度計(jì)的使用參見《基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[8].

1.5菌株的形態(tài)學(xué)觀察(1)菌落形態(tài)的觀察.將菌株接種于黃原膠固體平板培養(yǎng)基上中,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察平板上菌落的生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài).(2)革蘭氏染色和芽胞染色.詳細(xì)步驟參見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[9].

1.6菌株的常規(guī)生理生化特征的鑒定將菌株接種于富集培養(yǎng)基中,于37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h后,參照Nankai H等[10-11]報(bào)道的方法,對(duì)該菌株分別進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇(V·P)試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)以及接觸酶試驗(yàn).

1.7菌株的碳源及氮源的選擇將菌株接種至碳源利用基本培養(yǎng)基和氮源利用基本培養(yǎng)基中,37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)72 h,連續(xù)傳代3次,觀察菌株的生長(zhǎng)情況,生長(zhǎng)則為陽(yáng)性,不生長(zhǎng)則為陰性.測(cè)試用的碳源有蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇和鼠李糖.測(cè)試用的氮源有尿素、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨、硝酸鈉和酪蛋白.碳源基本培養(yǎng)基用選擇的碳源替代富集培養(yǎng)基中的黃原膠;氮源基本培養(yǎng)基用選擇的氮源替代富集培養(yǎng)基中的硝酸鉀.

1.8菌株的16SrDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建當(dāng)菌株細(xì)胞濃度OD600達(dá)到0.2～0.3時(shí),進(jìn)行總DNA的抽提.將已抽提出的菌株總DNA作為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出該菌株16S rDNA片段[7].采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR的產(chǎn)物,再將PCR的產(chǎn)物交給上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行目的片段基因測(cè)序,并將測(cè)序得到的基因序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì),搜索相匹配的相關(guān)序列作為參比,用CLUSTAL X1.8.1軟件進(jìn)行序列比對(duì),MEGA 3.1軟件繪制供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹.

設(shè)計(jì)菌株 16S rDNA擴(kuò)增引物[12],Primer F:F27(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′),Primer R:R1492(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′).

2 結(jié)果與分析

2.1黃原膠降解菌的篩選經(jīng)過富集培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng),從保存的菌液中篩選出一株能降解黃原膠的菌株,將其命名為XD-09.挑取一株單菌落進(jìn)行培養(yǎng),繪制其生長(zhǎng)曲線.圖1所示的XD-09生長(zhǎng)曲線表明,菌株在生長(zhǎng)至第10～16 h,其OD值急劇增大,表明菌株進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.

2.2菌株XD-09在培養(yǎng)過程中粘度的變化如圖2所示,當(dāng)菌株XD-09在黃原膠選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),培養(yǎng)液的粘度逐漸下降,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到第18～30小時(shí),培養(yǎng)液的相對(duì)粘度下降較明顯,表明黃原膠多糖被降解了.

圖1 菌株XD-09的生長(zhǎng)曲線

圖2 菌株XD-09在培養(yǎng)中的粘度變化

2.3菌株XD-09的菌落形態(tài)觀察由圖3可見,菌株XD-09在黃原膠固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了24 h后,菌落呈圓形不透明狀,乳白色,濕潤(rùn),表面光滑,邊緣整齊.

2.4菌株XD-09的革蘭氏染色圖4所示是菌株經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下圖像,菌株XD-09經(jīng)革蘭氏染色后,菌體呈藍(lán)紫色,初步確定菌株XD-09為革蘭氏陽(yáng)性菌.

2.5菌株XD-09的芽胞染色如圖5所示,在桿狀菌體外包著一層綠色的卵圓形芽胞結(jié)構(gòu),由此表明,菌株XD-09可以產(chǎn)生芽胞.

圖3 XD-09在黃原膠固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況

圖4 菌株XD-09的革蘭氏染色結(jié)果(×1 000)

圖5 菌株XD-09的芽胞染色(×40)

2.6菌株XD-09的生理生化特征及對(duì)碳源氮源的利用菌株XD-09的生理生化試驗(yàn)結(jié)果為:明膠液化實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)及接觸沒試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,其他結(jié)果為陰性.

菌株的碳源及氮源利用結(jié)果為:蔗糖、木糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖為陽(yáng)性,其他為陰性;尿素、硝酸鉀、氯化銨、酪蛋白為陽(yáng)性,其他為陰性.

根據(jù)菌株形態(tài)及生理生化特征等方面的鑒定結(jié)果,對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14],初步確認(rèn)該菌株屬于芽胞桿菌屬(Bacillus).

2.7菌株XD-09的16SrDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果抽提菌株XD-09的基因組,并以基因組DNA為模板,擴(kuò)增出菌株XD-09的16S rDNA片段,瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約為1 500 bp,該片段大小與預(yù)期目的片段大小一致.序列交給上海桑尼生物公司測(cè)序.

將測(cè)序得到的基因序列進(jìn)行Blast比對(duì),搜索相匹配的相關(guān)序列.搜索結(jié)果顯示,有14株菌的16S rDNA序列與菌株XD-09具有94%以上的相似性.將這14株菌株作為參比菌株,進(jìn)行序列比對(duì)并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹.從圖6可見,菌株XD-09與芽孢桿菌屬(Bacillus)的幾株細(xì)菌聚于一群,且與韋氏芽孢桿菌(BacillusweihenstephanensisstrainDSM11821)的關(guān)系最接近[15].

圖6 菌株XD-09在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置

3 結(jié)論

1)本實(shí)驗(yàn)的菌株XD-09可在以黃原膠為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),并可降低培養(yǎng)液的粘度,由此說明菌株XD-09可對(duì)黃原膠進(jìn)行降解利用.

2)根據(jù)菌株XD-09的形態(tài)特征及生理生化特征的研究結(jié)果,對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,初步確認(rèn)該菌株屬于芽孢桿菌屬.

3)通過菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)菌株XD-09與芽孢桿菌屬的幾株細(xì)菌聚于一群,且與韋氏芽孢桿菌DSM11821在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上最接近.

結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育分析等研究結(jié)果,確認(rèn)菌株XD-09屬于芽孢桿菌科的芽孢桿菌屬.國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道其他屬的可降解黃原膠的菌株,如劉晗等[7]報(bào)道的可降解黃原膠的菌為鞘氨醇單胞菌,但本實(shí)驗(yàn)確定的菌株XD-09為芽孢桿菌屬,且該菌株降解黃原膠的能力較強(qiáng),可為進(jìn)一步開展菌株的誘變選育及改良奠定基礎(chǔ).

[1] 聶凌鴻,周如金,寧正祥.黃原膠的特性、發(fā)展現(xiàn)狀、生產(chǎn)及其應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑,2003(3):82-85.

[2] Higiro J, Herald T J, Alavi S, et al. Rheological study of xanthan and locust bean gum interaction in dilute solution[J]. Food Res Inr,2006,39:165-175.

[3] 謝俊,梁會(huì)珍.黃原膠作為油田驅(qū)替劑的性能研究[J].礦物巖石,2003,(32)2:103-107.

[4] 黃成棟,王洪榮,白雪芳,等.黃原膠降解菌的篩選及其降解酶性質(zhì)的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2005,32(1):32-37.

[5] 古麗·艾合買提,穆斯塔帕.黃原膠降解菌的篩選及誘變選育[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,45(1):79-83.

[6] 易紹金,李炳金,胡凱.黃原膠降解菌的篩選及紫外誘變選育[J].石油天然氣學(xué)報(bào),2010,32(5):118-120.

[7] 劉晗,劉鵬,崔鐵軍,等.1株黃原膠降解菌的鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2006,7(5):81-86.

[8] 古鳳才,肖衍繁.基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:科學(xué)出版社,2001:409-415.

[9] 沈萍,陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,2007:134-137.

[10] Nankai H, Hashimoto W, Miki H, et al. Microbial system for polysaccharide depolymerisation: enzymatic route for xanthan depolymerisation byBacillussp.Strain GL-1[J]. Appl Environ Microbiol,1999,65:2520-2526.

[11] Nankai H, Hashimoto W, Miki H, et al. Xanthan lyase ofBacillussp.Strain GL-1liberates pyruvylated mannose from Xanthan side chains[J]. Appl Environ Microbiol,2000,66:3765-3768.

[12] 都立輝,劉芳.16S r RNA基因在細(xì)菌菌種鑒定中的應(yīng)用[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2006(5):207-209.

[13] Holt J. Bergey’s manual of determinative bacterial[M]. Baltimore: Williams and Wilkins,1994.

[14] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[15] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res,2000,24:4876-4882.