賈 晶 王振生 高宇輝 劉 娟 王 恒

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院，北京 100005)

瘧疾是世界上最嚴重的寄生原蟲感染性疾病之一，一直以來都威脅著人類健康(WHO，2012)。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，瘧原蟲的相關(guān)研究也日益深入，瘧原蟲基因及其編碼蛋白功能的揭示為瘧疾防治提供了新思路。由于鼠瘧原蟲基因改造技術(shù)的廣泛推廣及其完整生命周期分析的可實現(xiàn)性(Janseetal.，2011)，使得鼠瘧原蟲成為研究人類瘧原蟲使用最頻繁的模式生物。近年來反向遺傳學技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于研究瘧原蟲基因功能及其與宿主間相互作用的分子機制(Carvalhoetal.，2005；Bauletal.，2007)。基因的靶向破壞成為深入研究瘧原蟲基因定位及其表達蛋白的功能的重要手段。而這些研究均以轉(zhuǎn)染作為基礎(chǔ)的應用技術(shù)之一。為保證轉(zhuǎn)染的高效性，通常采用體外培養(yǎng)的方法可以使瘧原蟲發(fā)育至成熟裂殖體期后停止生長(Janseetal.，2006),從而獲得大量成熟裂殖體，將其及發(fā)育完全的裂殖子作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對象。但是傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時間長達20～22 h(陳俊等，2006)，期間對于培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻，難以保持穩(wěn)定。本文就伯氏瘧原蟲PbANKA1596cl1體外培養(yǎng)方法進行優(yōu)化，為進一步提高鼠瘧轉(zhuǎn)染效率奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

伯氏瘧原蟲PlasmodiumbergheiANKA(PbANKA1596cl1，后文用Pb1596代替)由荷蘭萊頓大學(Leiden University Medical Center，LUMC)Shahid Khan教授的瘧疾研究課題組惠贈，為新型轉(zhuǎn)染體系GIMO(Linetal.，2011)模式生物；6～8周齡的ICR小鼠(雌性，18～20 g,北京維通利華實驗動物有限公司)、RPMI-1640細胞培養(yǎng)液(北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心)、Nycodenz (Sigma)、各種型號離心管(BD公司)、細胞培養(yǎng)瓶(Corning, USA)、恒溫培養(yǎng)箱(北京國光醫(yī)化儀器廠)、顯微鏡(Olympus CH，Japan)、水平離心機(Eppendorf，Germany)。

1.2 實驗方法

1.2.1蟲株復蘇：液氮中保存良好的伯氏瘧原蟲Pb1596，迅速置于37 ℃水浴，融化后移入15 mL離心管，逐滴加入0.2倍體積的12% NaCl與 9倍體積的1.6% NaCl洗滌細胞，2 000 r/min，3 min,棄上清；再用9倍體積的0.9% NaCl+0.2%葡萄糖洗滌細胞，2 000 r/min，3 min，棄上清；0.9% NaCl+0.2%葡萄糖溶液按照所用體積重懸下層細胞沉淀后，100 μL/只尾靜脈注射入健康ICR小鼠體內(nèi)。

1.2.2傳代培養(yǎng)：經(jīng)尾靜脈接種的ICR小鼠，待原蟲率達5%～15%，尾靜脈取血2～4滴于400 μL枸櫞酸鈉PBS中, 混勻后以200 μL/只腹腔接種健康ICR小鼠2只 。

1.2.3原蟲率計算：腹腔接種感染后每天固定時間小鼠尾部采血，血細胞涂片，甲醇固定，姬姆薩原液與水1∶6配制染液染色15 min后100×油鏡觀察。原蟲率=感染紅細胞數(shù)/所計數(shù)區(qū)域內(nèi)全部紅細胞總數(shù)。

1.2.4Pb1596體外培養(yǎng)：實驗中為比較優(yōu)化前后方法效果的不同，采用兩種方法體外培養(yǎng)Pb1596，傳統(tǒng)方法完全按照文獻(Janseetal.，2006)操作；優(yōu)化后的方法為：腹腔接種的小鼠4～5 d后，原蟲率達5%～15%，且大部分原蟲處于滋養(yǎng)體期。心臟穿刺取血用10倍體積的枸櫞酸鈉PBS混勻后1 600 r/min離心8 min，棄上清；細胞沉淀用10倍體積的完全培養(yǎng)基重懸后1 600 r/min離心8 min，棄上清；用7倍體積的完全培養(yǎng)基再次重懸細胞沉淀，并緩慢加入事先添加3 mL 55% Nycodenz工作液(55 mL Nycodenz 儲存液/45 mL RPMI-1640)的離心管，1 600 r/min離心20 min。所需滋養(yǎng)體期感染紅細胞位于中間層面，將其小心吸入50 mL離心管中，加入10倍體積的完全培養(yǎng)基，混勻后1 600 r/min離心8 min，棄上清； 1 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，注入事先加入9 mL完全培養(yǎng)基的 25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，并在瓶中注入體積比為 5∶3∶92的CO2、O2和N2的混合氣體30～60 s，迅速擰緊瓶口，37 ℃，40 r/min(細胞處于懸浮狀態(tài)即可)低速振蕩培養(yǎng)8～10 h。每種方法均使用購于同一公司的6～8周齡ICR小鼠1只，培養(yǎng)蟲血體積均處于0.6～0.7 mL。

1.2.5細胞生長狀態(tài)觀察：體外培養(yǎng)相應時間后(傳統(tǒng)方法：20～22 h，優(yōu)化后：8～10 h)，取500 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min急速離心10 s，棄上清，沉淀染色15 min，100×油鏡觀察細胞生長狀態(tài)。

1.2.6同一生長周期內(nèi)不同發(fā)育階段瘧原蟲形態(tài)觀察：在瘧原蟲一個生長周期內(nèi)每隔2 h小鼠尾部采血顯微鏡觀察計數(shù)不同發(fā)育階段蟲株所占比例。成熟裂殖體(%)=成熟裂殖體感染紅細胞數(shù)/全部感染紅細胞總數(shù)；滋養(yǎng)體(%)=滋養(yǎng)體感染紅細胞數(shù)/全部感染紅細胞總數(shù)。

1.2.7細胞存活率計算：細胞懸浮液適當倍數(shù)稀釋，按照100∶1的比例臺盼藍染色，靜置 1 min后活細胞計數(shù)。細胞存活率(%)=活細胞總數(shù)/總細胞數(shù)。

1.2.8數(shù)據(jù)分析：SPSS統(tǒng)計學軟件，表1結(jié)果采用兩獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 伯氏瘧原蟲Pb1596生長趨勢

觀察正常情況下小鼠體內(nèi)伯氏瘧原蟲Pb1596生長狀態(tài)，繪制生長曲線如圖1。正常情況下Pb1596感染的小鼠可存活1周，感染當天記為d0，第2 d記為d1，依次類推。感染后小鼠原蟲率呈遞增趨勢，d3時達1%～3%，此時為傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法采血最佳區(qū)間(Janseetal.，2006)；d4～d5升至5%～15%，此時小鼠及瘧原蟲狀態(tài)良好，瘧原蟲生長處于對數(shù)期，是小鼠感染傳代最佳區(qū)間，因此為保證體外短期培養(yǎng)細胞高存活率，并增大裂殖體比例，達到良好的培養(yǎng)效果，本實驗中優(yōu)化方法的采血時間定為此區(qū)間。

圖1 伯氏瘧原蟲Pb1596生長曲線Fig.1 Growth curve of the Pb1596

圖2 伯氏瘧原蟲Pb1596同一生長周期內(nèi)發(fā)育特征Fig.2 Characteristics of Pb1596 in one growth cycle左側(cè)Y軸：同一生長周期內(nèi)不同期瘧原蟲感染紅細胞所含百分比；右側(cè)Y軸：同一生長周期內(nèi)原蟲率變化。Left Y-axis: the proportion of RBC infected by parasites at the different stage; Right Y-axis: the parasitemia in one growth cycle.

2.2 伯氏瘧原蟲Pb1596同一生長周期內(nèi)發(fā)育特征

在保證小鼠正常生長狀態(tài)下，體內(nèi)伯氏瘧原蟲的生長周期為22～24 h(Janseetal.，2006)。同一生長周期內(nèi)蟲株發(fā)育特征如圖2所示，同一周期內(nèi)，成熟裂殖體感染紅細胞所占比例處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，且均小于2.5%，不足以達到轉(zhuǎn)染所需水平，相同時間點，滋養(yǎng)體感染紅細胞比例達30%～55%，其比例遠遠高于同期裂殖體，將其富集后體外培養(yǎng)可以成為提高成熟裂殖體比

例的候選方法之一。

2.3 體外培養(yǎng)方法優(yōu)化前后差異

在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上本實驗從采血時原蟲率、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)體積等方面對伯氏瘧原蟲體外培養(yǎng)方法進行改進，如表1。采血原蟲率的提高保證了滋養(yǎng)體較高的含量，縮短體外培養(yǎng)時間避免血細胞長時間處于體外不穩(wěn)定生長環(huán)境，包括環(huán)境氣體比例、pH等。因此,本實驗優(yōu)化后在保證細胞高存活率的同時縮短實驗周期，使裂殖體保持良好發(fā)育狀態(tài)，提高成熟裂殖體比例并增加單個裂殖體所含裂殖子數(shù)目，為進一步提高轉(zhuǎn)染效率奠定良好基礎(chǔ)。

2.4 體外培養(yǎng)方法優(yōu)化前后蟲株生長狀態(tài)比較

兩種方法實驗前后蟲株生長狀態(tài)如圖3所示，優(yōu)化后成熟裂殖體比例顯著增加，且有大量游離的發(fā)育完全的裂殖子，可被一同收集，充分利用，且單個裂殖體所含裂殖子數(shù)目增多，有助于提高轉(zhuǎn)染成功率。

表1 兩種方法培養(yǎng)伯氏瘧原蟲Pb1596的差異Tab.1 Differences about the Pb1596 culture conditions between the two methods

注：表中數(shù)據(jù)為3組獨立重復實驗平均值±標準差(SD)，*表示P<0.05。

Note: Data in the table are the averages of three sets of independent repeated experiments ±SD (*P<0.05).

圖3 優(yōu)化前后伯氏瘧原蟲Pb1596生長狀態(tài)差異Fig.3 Growth status difference of the Pb1596 before and after optimizationA．傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)前紅細胞及瘧原蟲形態(tài)，箭頭所指為感染紅細胞，此時原蟲率為1.86%；B.傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)前紅細胞及瘧原蟲形態(tài)，箭頭所指也為感染紅細胞，此時原蟲率為11.22%；C.傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)22 h后瘧原蟲形態(tài)，箭頭所指為成熟裂殖體，圈中為游離裂殖子；D.優(yōu)化方法體外培養(yǎng)9 h時后瘧原蟲形態(tài)，箭頭所指為成熟裂殖體，圈中為游離裂殖子.A. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the traditional method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is 1.86%; B. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the improved method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is11.22%;C: Parasites after in vitro cultivation for 22 hours using the traditional method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites; D. Parasites after in vitro cultivation for 9 hours using the improved method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites.

3 討論

轉(zhuǎn)染技術(shù)的推廣加快了反向遺傳學技術(shù)的廣泛應用，為實現(xiàn)其基因功能的研究帶來新的曙光。將外源DNA導入寄生于紅細胞的瘧原蟲細胞核，必須經(jīng)過紅細胞膜、納蟲空泡膜、瘧原蟲細胞膜和蟲體細胞核膜4層膜，實際進入蟲體核內(nèi)的DNA大大減少。而只有當瘧原蟲處于成熟裂殖體及發(fā)育充分的裂殖子時才有利于外源DNA的進入，所以，成熟裂殖體比例對于瘧原蟲轉(zhuǎn)染效率的影響十分重要。盡管通常采用的體外20～22 h培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染效率已經(jīng)優(yōu)于之前的報道(van Dijketal.，1995；Menardetal., 1997)，但體外瘧原蟲培養(yǎng)環(huán)境中pH值、培養(yǎng)基能量供應及氣體含量等條件要求苛刻，在整個培養(yǎng)過程中不易保持穩(wěn)定，加大了操作難度。針對上述問題，本實驗室對其體外培養(yǎng)方法進行優(yōu)化，通過采集瘧原蟲生長至對數(shù)期的感染紅細胞，離心富集滋養(yǎng)體期感染紅細胞，體外短期培養(yǎng)8～10 h，提高了成熟裂殖體比例，增加單個裂殖體所含裂殖子數(shù)目，且縮短了實驗周期。此外，傳統(tǒng)方法的操作是在體外培養(yǎng)后梯度離心分離成熟裂殖體，此時游離裂殖子不能一同被收集，而本實驗中先梯度分離再進行體外培養(yǎng)，最終將游離裂殖體一同收集，增加了裂殖子利用率。然而，本實驗操作過程中出現(xiàn)細胞存活率小范圍(<1%)下降現(xiàn)象，在今后的實驗中從細胞與培養(yǎng)基比例，氣體含量等方面仍有待改進。