王 欣 孫 毅** 牛思博 蔣寶貴

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032; 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150006)

全溝硬蜱Ixodespersulcatus棲息于寒帶及寒溫帶的針—闊混交林，主要寄生野生動(dòng)物(嚙齒類、牛、狗、兔)和家畜，也侵襲人。其危害不僅限于叮咬引起的失血、中毒、過(guò)敏等癥，更重要的是它可以傳播螺旋體、無(wú)形體、立克次氏體、巴貝西原蟲(chóng)、泰勒原蟲(chóng)等致病微生物(Mulengaetal., 2000; Jaworski, 2003)，引起人和動(dòng)物疾病的暴發(fā)流行。與其吸血量大且時(shí)間較長(zhǎng)的吸血過(guò)程相適應(yīng)，硬蜱涎腺分泌物中含有大量生物活性的蛋白，發(fā)揮著舒張血管、抗凝、抗補(bǔ)體和抗宿主免疫等作用，不僅有利于蜱類吸附吸血，也有助于病原在宿主體內(nèi)中定殖(Francischettietal., 2010)。如，可水解ATP三磷酸腺苷雙磷酸酶、血小板聚集抑制劑 (Ribeiroetal., 1985; Titusetal., 1990; Mansetal., 2000)、補(bǔ)體抑制物Isac (Lawrieetal., 1999; Valenzuelaetal., 2000)、促進(jìn)埃立克體及無(wú)形體成功傳播的涎腺蛋白Salp16 (Sukumaranetal., 2006)和宿主免疫抑制劑HBPs (Paesenetal., 1999)等。涎腺分泌物已成為蜱類吸血和介導(dǎo)病原體傳播的重要成分。目前，已從分布北美肩突硬蜱I.scapulrius的涎腺中發(fā)現(xiàn)了Salivary protein 15 kDa，(簡(jiǎn)稱Salp15，下同)，并證實(shí)其對(duì)萊姆病病原之一伯氏螺旋體的北美株Borreliaburgdorferisensustricto具有保護(hù)作用, 并發(fā)現(xiàn)通過(guò)免疫宿主拮抗Salp15的功能，可有效降低肩板硬蜱對(duì)萊姆病螺旋體的傳播效率(Ramamoorthietal., 2005; Hoviusetal., 2008; Daietal., 2009)?？梢?jiàn)，拮抗媒介蜱涎腺功能蛋白可望成為阻礙病原體傳播、預(yù)防蜱媒疾病發(fā)生的重要策略之一，并可由此開(kāi)發(fā)出市場(chǎng)前景巨大的新型傳播阻斷性疫苗應(yīng)用于蜱媒病防治。然而，由于自然環(huán)境和地理?xiàng)l件的差異，媒介蜱種和病原體的不同可能使這一應(yīng)用前景受到質(zhì)疑。為了明確這種保護(hù)性機(jī)制的蛋白在我國(guó)的重要傳播媒介中是否存在，是否具有類同的功能和開(kāi)發(fā)價(jià)值，本文以我國(guó)萊姆病的主要傳播媒介全溝硬蜱為對(duì)象，開(kāi)展涎腺蛋白Salp15的相關(guān)研究，首次獲得了Salp15蛋白并成功完成其原核表達(dá)，為開(kāi)展后續(xù)的功能研究及疫苗開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蜱：全溝硬蜱I.persulcatus，為本實(shí)驗(yàn)室人工繁殖第2代的實(shí)驗(yàn)種群，采集于黑龍江省牡丹江市大石溝林區(qū)?？寺【闑.coliTrans5α，表達(dá)菌株E.coliTransetta (DE3)，pEASYTM-T1 Simple 克隆載體購(gòu)于北京全式金公司。pMAL-c4X表達(dá)載體，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ，Amylose Resin，T4 連接酶購(gòu)于NEB 公司。 表達(dá)菌株E.coliRosseta (DE3)，山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP，麗春紅染色試劑，TBST緩沖液購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司。RNeasy mini kit購(gòu)于QIAGEN公司。MBP-Tag Mouse Monoclonal Antibody購(gòu)于Anbo 公司。First-Strand Synthesis System購(gòu)于英駿公司。Premix Taq 購(gòu)于Takara公司。QIAquick Gel Extraction Kit 購(gòu)于QIAGEN 公司。質(zhì)粒DNA小量試劑盒 購(gòu)于Axygen公司。pMALTMProtein Fusion and Purification System 購(gòu)于NEB公司。蛋白定量試劑盒購(gòu)于Bradford公司。

1.2 方法

1.2.1試蜱叮咬實(shí)驗(yàn)：為本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)種群的幼蜱。將15只幼蜱置于昆明鼠(SPF級(jí),4周齡，雄性)腹部，每組15只幼蜱叮咬3 d，至半飽血，立即用鑷子取下。3組重復(fù)。RNA提取：將半飽血蜱放入已加液氮的研缽，充分研磨，按RNeasy mini kit試劑盒操作手冊(cè)提取全蜱RNA。按First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒立即逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系如下：RNA(1.5 μg), oligo dT (20 pmol)總體系20 μL。逆轉(zhuǎn)錄之后，立即取2.5 μL cDNA PCR擴(kuò)增目的基因。引物設(shè)計(jì)：參照GenBank 中已存在的Salp15同源家族的CDS序列設(shè)計(jì)-肩突硬蜱I.scapularis(AAK97817),篦子硬蜱I.ricinus(EU128526), 全溝硬蜱I.persulcatus(ACV32167)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物如下:上游引物F-salp: 5′-ATGGAATCTTTCGTCGCAATG-3′；下游引物R-salp: 5′-CTAACATCCGGGAATGTGC-3′。擴(kuò)增條件：采用Premix Taq, 無(wú)菌水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min; 94℃ 30 s， 53℃ 40 s，72℃ 1 min，9個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s， 51℃ 40 s，72℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃恒溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)按照常規(guī)方法進(jìn)行。對(duì)照基因：以全溝硬蜱的管家基因β-actin基因作為陽(yáng)性對(duì)照。其擴(kuò)增引物為，上游引物Factin：5′-ATGTGTGACGACGAGGTTGCCG-3′;下游引物Ractin: 5′-TTAGAAGCACTTGCGGTGG ACAATG-3′。擴(kuò)增條件除了退火溫度設(shè)為55℃，其余同Salp15基因擴(kuò)增參數(shù)。

1.2.2Salp15同源家族基因的克隆及鑒定分析：按QIAquick Gel Extraction Kit的操作說(shuō)明對(duì)PCR 擴(kuò)增的目的產(chǎn)物切膠純化，立即取4 μL 產(chǎn)物與1 μL pEASYTM-T1 Simple 克隆載體相連，25℃ 30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliTrans5α 感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇1 h，涂于LB固體平板(氨芐青霉素濃度為100 μg/mL)，37℃過(guò)夜。第2 d，挑取白色菌斑-單克隆，至3 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌6.5 h。按AxyPrep 質(zhì)粒DNA小量試劑盒試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒，送至上海生工測(cè)序。共挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序。

經(jīng)北京大學(xué)生物信息學(xué)平臺(tái)weblab對(duì)此序列與其他已知Salp15蛋白進(jìn)行兩兩比對(duì)(Liuetal., 2009)，得此序列在氨基酸水平與核苷酸水平與其他類似蜱種Salp15蛋白的相似性和一致性。此外，對(duì)其蛋白序列與其他Salp15蛋白經(jīng)Clustal X2做多序列比對(duì)，預(yù)測(cè)Salp15家族蛋白的保守性位點(diǎn)。由于Salp15是唾液腺分泌蛋白，因此推測(cè)其具有信號(hào)肽，用在線預(yù)測(cè)軟件Signal P 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 對(duì)所得序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3Salp15同源家族基因的原核重組蛋白表達(dá)、純化：以FE：5′-CGGAATTCATGGAATCT TTCGTCGCAATG-3′;RS: 5′-GCGTCGACCTAA CATCCGGGAATGTGC-3′對(duì)I.p larva5的cDNA PCR擴(kuò)增，增加EcoRⅠ，SalⅠ酶切位點(diǎn)，切膠純化PCR產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物以及pMAL-c4X表達(dá)載體雙酶切，T4連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至Trans5α，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并測(cè)序鑒定成功插入表達(dá)載體。陽(yáng)性載體轉(zhuǎn)化入E.coliTransetta (DE3)簡(jiǎn)寫為Transetta(pMAL-c4X′)，空載體轉(zhuǎn)化入E.coliTransetta (DE3)為Transetta(pMAL-c4X)。部分陽(yáng)性質(zhì)粒-80℃保存，5 μL 陽(yáng)性載體轉(zhuǎn)化入E.coliTransetta (DE3)、E.coliRosseta (DE3)， 挑取單克隆培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h, 10 000 r/min離心2 min收集菌體。磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH7.4, PBS)洗3遍，預(yù)留1管菌體加蛋白上樣緩沖液直接煮沸5 min，使菌體總蛋白變性。另取1管菌體超聲波破碎，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 2 min，分離上清，重懸浮沉淀。蛋白SDS-PAGE檢測(cè)，重組蛋白分子量約為60 kDa。純化步驟按pMALTMProtein Fusion and Purification System操作手冊(cè)純化。

1.2.4Salp15同源家族原核重組蛋白鑒定：首先按照 BioMed 公司的Bradford試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果濃度為1.2 mg/mL，確定蛋白樣品上樣25 μL即30 μg。SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)NC膜，Western Blot封閉液Ⅱ(CWbio.Co.Ltd)室溫封閉30 min。孵育一抗, 1∶5 000稀釋比例稀釋MBP抗體(Maltose-binding protein), 完全浸潤(rùn)NC膜，室溫孵育30 min后，放于4℃過(guò)夜。TBST洗膜5次，每次3 min，加山羊抗小鼠IgG-HRP(IgG-horseradishperoxidase)，1∶4 000稀釋，室溫孵育40 min。TBST洗膜5次，每次3 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，成像系統(tǒng)曝光并拍照。

2 結(jié)果

2.1 全溝硬蜱Salp15 蛋白家族目的基因及序列分析

以全溝硬蜱幼蜱的RNA為模板，oligo dT逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 成功擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶大小約420 bp左右(圖1)。經(jīng)載體連接，挑取單克隆測(cè)序，成功測(cè)序16個(gè)。

經(jīng)克隆測(cè)序獲得長(zhǎng)度為414 bp的序列，經(jīng)Blast比對(duì)(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST)，鑒定此CDS序列翻譯的蛋白屬于Salp15 蛋白超家族成員，翻譯后的蛋白具有137個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)的分子量為15 476 Da(DNAStar)，經(jīng)SignalP 4.0預(yù)測(cè)在肽鏈的N端還有信號(hào)肽(圖2)。該蛋白在83～137位具有保守位點(diǎn)(圖3)，將此Salp15同源蛋白命名為I.p larva5, GenBank登錄號(hào)為(HE820731)。

圖1 全溝硬蜱幼蜱中Salp15基因的擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplified for Salp15 genes from larva of I.persulcatusM: DL2000; 1: 目的蛋白基因cDNA of I.p larva 5；2: 對(duì)照基因β-Actin.M: DL2000; 1: Target gene cDNA of I.p larva5; 2: β-Actin gene as positive control.

經(jīng)兩兩比對(duì)，I.p larva5(HE820731)與篦子硬蜱I.ricinus的Salp15 iric3(ABU93615) 氨基酸水平的相似性最大為74.5%，與太平洋硬蜱I.pacificus的相似性最小為55.1%(表1)，在所有的不同來(lái)源的Salp15中，俄羅斯西伯利亞地區(qū)的全溝硬蜱Salp15與日本的全溝硬蜱的iper2 (BAH09311)、歐洲的篦子硬蜱iric1 (EU128526)相似性最大，分別為89.1%、87.4%；太平洋硬蜱pacificus (ACV32166)與I.p larva5相似性最小為55.1%(表1)。

2.2 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒

經(jīng)PCR方法在I.p larva5在其5′、3′端分別加上EcoRⅠ，SalⅠ酶切位點(diǎn)。連入pMAL-c4X, 經(jīng)雙酶切以及測(cè)序鑒定，正常插入。測(cè)序結(jié)果顯示成功正確連入表達(dá)載體，說(shuō)明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。成功插入的陽(yáng)性載體命名為pMAL-c4X′。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)、純化所得目的蛋白

重組pMAL-c4X′ 分別轉(zhuǎn)入E.coliTransetta (DE3)、E.coliRosseta (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體總蛋白煮沸變性經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，重組融合蛋白大部分可溶，大小約為60 kDa(圖4)。經(jīng)比較，E.coliTransetta (DE3)表達(dá)效果好于E.coliRosseta (DE3)。純化方法按照pMALTMProtein Fusion and Purification System 操作手冊(cè)純化目的蛋白。經(jīng)不同濃度的麥芽糖洗脫液洗脫，確定麥芽糖最佳洗脫濃度為8 mmol/L(圖5)。

表1 同一家族的Salp15成員氨基酸水平、核苷酸水平的相似性比較Tab.1 The similarities of Salp15 homologues in amino acid level and nucleotides level

注：I.p larva5(HE820731)來(lái)自全溝硬蜱; iper (ACV32167), iper1 (BAH09310), iper2 (BAH09311)來(lái)自于歐亞全溝硬蜱; iric1 (EU128526), iric2 (ABU93614), iric3(ABU93615)來(lái)自于歐洲篦子硬蜱; scapularis(AAK97817)來(lái)自于肩突硬蜱；pacificus (ACV32166)來(lái)自于太平洋硬蜱。表中粗體為一致性，正體為相似性.

Note: I.p larva5(HE820731)fromI.persucatu(this study); iper (ACV32167), iper1 (BAH09310), iper2 (BAH09311) from Eurasian; iric1 (EU128526), iric2 (ABU93614), iric3(ABU93615) fromI.ricinus; scapularis (AAK97817) fromI.scapularis; pacificus (ACV32166) fromI.pacificus. Bold mean identity, normal mean similarities.

圖2 I.p larva5 核苷酸與氨基酸信息Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of cDNA encoding I.p larva5下劃線殘基為推測(cè)的信號(hào)肽序列.Predicted signal peptide is underlined.

圖3 來(lái)源于不同硬蜱的Salp15超家族蛋白多序列比對(duì)Fig.3 Alignment of I. persulcatus Salp15 with other Salp15 homologues方框中序列為預(yù)測(cè)的Salp15 與CD4分子結(jié)合位點(diǎn)。不同序列間一致的氨基酸殘基、高度保守的殘基、相似的殘基分別用星號(hào)、分號(hào)、句號(hào)標(biāo)注。I.p larva5(HE820731)來(lái)自全溝硬； iper(ACV32167), iper1(BAH09310), iper2(BAH09311)來(lái)自于歐亞全溝硬蜱; iric1(EU128526), iric2(ABU93614), iric3(ABU93615)來(lái)自于歐洲篦子硬蜱；來(lái)自于肩突硬蜱scapularis (AAK97817)；pacificus (ACV32166)來(lái)自于太平洋硬蜱。Positions of amino acid sequence identity, amino acid residue similarity and highly conserved amino acid substitutions are marked by an asterisk, full stop and colon, respectively. Cluster of differentiation (CD)4 binding site in putative Salp15 were boxed based on the report by. I.p larva5(HE820731)from I. persucatu (this study); iper(ACV32167), iper1(BAH09310), iper2(BAH09311) from Eurasian; iric1 (EU128526), iric2(ABU93614), iric3(ABU93615) from I. ricinus; scapularis(AAK97817) from I. scapularis; pacificus(ACV32166) from I. pacificus.

圖4 菌體裂解液SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 SDS-PAGE assay of lysised bacteriaM：蛋白分子量標(biāo)記； 1, 2: Transetta (pMAL-c4X)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)上清及沉淀; 3, 4：Transetta (pMAL-c4X)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清及沉淀。5, 6：Transetta (pMAL-c4X′) 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)上清及沉淀；7, 8：Transetta (pMAL-c4X′) 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀；9, 10：Transetta (pMAL-c4X′) 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀; 11, 12: Transetta (pMAL-c4X′) 1.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀；13, 14: Transetta(pMAL-c4X′) 1.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)上清和沉淀.M: Protein molecular weight; 1, 2：Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X) uninduced；3, 4：Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X) induced by 1 mmol/L IPTG；5, 6：Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X′) uninduced; 7, 8: Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X′) induced by 0.5 mmol/L IPTG; 9,10: Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X′) induced by 1 mmol/L IPTG; 11, 12: Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X′) induced by 1.5 mmol/L IPTG; 13,14: Supernatant and precipitation of Transetta (pMAL-c4X′) induced by 1.8 mmol/L IPTG.

2.4 重組蛋白Western blotting 鑒定

pMAL-c4X 表達(dá)的重組蛋白帶有MBP標(biāo)簽，標(biāo)簽分子大小約為42.5 kDa (Nallamsettyetal., 2007)。SDS-PAGE顯示純化的重組目的蛋白分子大小約為60 kDa。以目的蛋白作為抗原，抗MBP的單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗，經(jīng)Western blot鑒定(圖7)。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前菌體總蛋白出現(xiàn)3個(gè)條帶，包括兩條非特異性條帶(100、48 kDa)，純化后只有一條目的條帶(約60 kDa)，純化效果顯著(圖5～7)。

圖5 純化重組蛋白Fig.5 Purification of recombinant proteinM：蛋白分子量標(biāo)記; 1: 流穿液; 4～9：麥芽糖洗脫液；2～3:無(wú)麥芽糖; 4～8:分別為1、2、4、8和10 mmol/L 麥芽糖洗脫液;9: 10 mmol/L 麥芽糖第2次洗脫.M: Protein molecular weight; 1: Dilution crude extract; 2-9: maltose elution; 2-3: non-maltose fraction; 4-8: 1, 2, 4, 8 and 10 mmol/L maltose elution; 9: 10 mmol/L maltose second elution.

圖6 重組Salp15蛋白純化結(jié)果Fig.6 The purification result of the recombinant Salp15M：蛋白分子量標(biāo)記; 1: 濃縮純化蛋白I.p larva5; 2：對(duì)照(牛血清白蛋白).M: Protein molecular weight; 1: Concentrated purified protein I.p larva5; 2: BSA as control.

圖7 Western bolt 鑒定重組蛋白Fig.7 Determination of recombinant protein by western blotM：蛋白分子量標(biāo)記; 1：誘導(dǎo)前菌體總蛋白; 2：誘導(dǎo)后菌體總蛋白; 3：純化后蛋白.M: Protein molecular weight; 1: Uninduced cells; 2: Induced cells; 3: Purified target protein.

3 討論

Salp15 是蜱類唾液腺一種分泌蛋白(Salivary protein 15 kDa), 最先發(fā)現(xiàn)于北美肩突硬蜱(GenBank登錄號(hào)AF209914)。它的功能與萊姆病螺旋體的傳播、定殖密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí)它能夠特異性結(jié)合CD4+T細(xì)胞的CD4分子，保護(hù)螺旋體免于被哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別、殺傷，并且直接抑制T細(xì)胞的激活，阻礙下游通路的開(kāi)啟(Anguitaetal., 2002; Gargetal., 2012)。如，導(dǎo)致Lck激活失敗，其早期的下游信號(hào)分子LAT 和Vav1的絡(luò)氨酸無(wú)法磷酸化(Juncadellaetal., 2007)。同時(shí)Salp15還特異性能與螺旋體外膜蛋白OspC 結(jié)合，有效保護(hù)螺旋體免于宿主抗體殺傷。來(lái)源于歐洲的篦子硬蜱的Salp15超家族成員Salp15 iric1既能夠與其伽氏疏螺旋體B.garinii和 埃氏疏螺旋體B.afzelii結(jié)合，也能夠與伯氏螺旋體北美株B.burgdorferisensustricto結(jié)合。但是，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Salp15 irc-1只能夠保護(hù)B.burgdorferisensustricto免于宿主抗體殺傷，卻不能夠保護(hù)B.garinii和B.afzelii(Hoviusetal., 2008), 篦子硬蜱的其他Salp15超家族成員Salp15 iric2, Salp15 iric3 可能有效保護(hù)B.garinii和B.afzelii的相應(yīng)地理株，促進(jìn)其有效傳播。由此可見(jiàn)，Salp15的多功能性有利于螺旋體以及蜱類共同逃避宿主的免疫系統(tǒng)殺傷，促進(jìn)螺旋體的成功傳播定殖，也有利于蜱類成功完成長(zhǎng)期的吸血過(guò)程(約7 d左右), 是媒介與病原，哺乳動(dòng)物共同進(jìn)化的結(jié)果。因此，研究人員提出Salp15用作傳播阻斷性疫苗的構(gòu)想，即，針對(duì)Salp15的非病原疫苗可有效阻斷螺旋體的傳播。肩突硬蜱的Salp15 與Salp25 的免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)，40%的Salp15 免疫鼠(3周后檢測(cè))能夠的有效免于伯氏螺旋體B.burgdorferi的感染，而Salp25無(wú)免疫效果；將Salp15與另一種蜱類抗原OspA共同免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)80%的小鼠免于感染(Daietal., 2009)。

截止目前，對(duì)于蜱類涎腺蛋白，只有肩突硬蜱的Salp15、篦子硬蜱的Salp15 iric1進(jìn)行了原核或真核表達(dá)，還未見(jiàn)全溝硬蜱的Salp15表達(dá)及下游研究。本文對(duì)I.p larva5成功進(jìn)行了原核表達(dá)，得到了大小約為60 kDa的重組蛋白。盡管該蛋白具有肽鏈C末端高度相似的典型特征，但氨基酸序列與已獲得表達(dá)其他Salp15蛋白存在差異，其功能及其與蜱媒病原傳播的關(guān)系是否存在差異還有待進(jìn)一步研究。

本文獲得的全溝硬蜱Salp15 超蛋白家族成員-I.p larva5，其肽鏈C末端與其他Salp15成員高度相似，其與肩突硬蜱核苷酸Salp15序列一致性為67.10%， 氨基酸的一致性為50%，相似性為62.3%，與Salp15 iric1 核苷酸序列一致性為66.70%，氨基酸序列的一致性為53.6%，相似性為61.6%(表1)。除了I.p larva5之外，本研究室還從全溝硬蜱中發(fā)現(xiàn)4條類似的Salp15蛋白(將另文發(fā)表)。此外，目前篦子硬蜱已發(fā)現(xiàn)有3種Salp15蛋白即iric1、iric2、iric3，分布于日本的全溝硬蜱已鑒定到2種Salp15蛋白iper1、iper2。經(jīng)比較，iper1與iper2相似性為58.3%; iric1與iric2、iric3相似性分別為61.9%、60.6%，iric2與iric3相似性為69.3%(表1)?？梢?jiàn)，Salp15不僅在不同蜱種中呈現(xiàn)出高度多樣性，相似性從55.1%至89.1%不等，即使在同一蜱種中也呈現(xiàn)一定的多樣性。其原因可能是(1)Salp15在蜱類中具有多種旁系同源的基因，每種基因表達(dá)一種Salp15蛋白；(2)Salp15在基因組中可能是一種基因，在轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)過(guò)加工，由一種前體Salp15變化為多家族的Salp15；(3)這些序列存在于轉(zhuǎn)錄組中，每一種產(chǎn)物不一定都表達(dá)，即，選擇性在蛋白水平表達(dá)，或者即使表達(dá)但不一定功能完全相同。譬如，Salp15 iric1保護(hù)B.burgdorferisensustricto免于宿主抗體殺傷，卻不能夠保護(hù)B.garinii和B.afzelii，Salp15 iric2， Salp15 iric3可能有效保護(hù)B.garinii和B.afzelii；(4)從已知的序列來(lái)看，分布北美的肩突硬蜱、太平洋硬蜱只有一種Salp15蛋白，這可能是目前只獲得了一種Salp15蛋白，其他蛋白家族成員還未有克隆。這些Salp15家族成員都具有7個(gè)半胱氨酸殘基，預(yù)示著其具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)和類似的功能。