張耀允 黎 浩 龔正達(dá) 趙曉光 劉 瑋**

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物學(xué)生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；3. 云南省地方病防治所，云南大理 675600)

巴爾通體Bartonella是一種寄生于脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的革蘭陰性桿菌(Boulouisetal.，2005)。目前，發(fā)現(xiàn)的巴爾通體有24種及亞種，其中至少12種可以引起人類(lèi)疾病(Hennetal.，2007)，如：貓抓病(Dolanetal.1993)、戰(zhàn)壕熱(Maurinetal.1996)、心內(nèi)膜炎(Drancourtetal.，1996)、桿菌性血管瘤(Koehleretal.，1992)等疾病。云南省位于中國(guó)西南部，其地形復(fù)雜，存在多種氣候類(lèi)型，因此小獸類(lèi)宿主分布廣泛。近年來(lái)，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了云南地區(qū)健康人群中存在巴爾通體感染(白瑛等，2004)。為進(jìn)一步研究其傳播途徑和防治方法提供重要依據(jù)，本次研究選取云南西北部高山地區(qū)，對(duì)其中小獸類(lèi)宿主感染巴爾通體的情況進(jìn)行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2005與2006年10～11月間，在云南西北部怒江傈僳族自治州和迪慶藏族自治州共選取10個(gè)采樣地。采樣點(diǎn)分布于海拔1 200～4 300 m之間，包括高寒山區(qū)、高原氣候、亞熱帶季風(fēng)季候、溫帶季風(fēng)氣候以及各氣候類(lèi)型間的過(guò)渡區(qū)域，該區(qū)域有豐富的物種多樣性。采用夾夜法捕捉野生小獸，然后無(wú)菌操作取脾臟，置于離心管中，液氮內(nèi)保存。

1.2 DNA提取

脾臟DNA提取：取10 mg脾臟樣本研磨后，采用TIANamp Genomic DNA Kit 組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，按說(shuō)明書(shū)逐步提取DNA。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

以提取的DNA為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)熱休克蛋白groEL基因(Inoueetal.，2009)進(jìn)行擴(kuò)增以證實(shí)是否存在巴通體，所用核苷酸引物： groEL277F：5′-ACTGTTTT(A/G)GGACA(A/G)GCTATTG-3′;GroEL572R：5′-TCAACG ACTTC(C/T)AATTCCGTT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度294 bp，以BartonellaquintanaRM-11(GenBank: CP003784)為陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系30 μL，DNA模板2 μL， 10×PCR緩沖液3 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，去離子水22.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán); 72℃后延伸7min，反應(yīng)在ABI 9700PCR儀上進(jìn)行。

1.4 電泳

PCR反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物5 μL加入1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB)的加樣孔中，用DL2000 DNA Marker 作參照(TaKaRa，大連)，120 V電壓下電泳30 min，取出膠塊，置于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

為避免污染引起假陽(yáng)性反應(yīng)，DNA的提取，反應(yīng)液的制備，模板DNA添加，PCR擴(kuò)增及電泳觀察均在不同的房間進(jìn)行，反應(yīng)液制備與模板DNA添加所用的移液器分開(kāi)專(zhuān)用，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)立空白(水)對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)比較不同小獸種間、氣候類(lèi)型及海拔間感染率差異，P<0.05判定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 捕獲動(dòng)物情況

本次研究共捕獲688只動(dòng)物，其中以姬鼠屬為優(yōu)勢(shì)鼠種共182只，其次為絨鼠屬151只、白腹鼠屬134只、鼩鼱類(lèi)112只、鼠兔屬39只、大足鼠29只、田鼠屬25只，其他小獸(松鼠、黃鼬等)15只。

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)出巴爾通體陽(yáng)性標(biāo)本72份，陽(yáng)性率為10.47%。所有陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)測(cè)序分析，均為巴通體的相應(yīng)序列(圖1)。

圖1 groEL基因片段的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis image of amplified groEL partial sequenceM：DL2000; 1：陽(yáng)性對(duì)照; 2～14: 陽(yáng)性樣本；15：空白對(duì)照。M: DL2000; 1: Positive control; 2-14: Positive samples; 15: Blank control.

按不同鼠種類(lèi)型進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，姬鼠屬陽(yáng)性率最高(46/182， 25.27%)，其樣本次為田鼠屬(2/25，8.00%)，絨鼠屬(9/151，5.96%)，大足鼠(2/29，6.90%)，白腹鼠屬(5/134，3.73%)，鼠兔類(lèi)(1/39，2.56%)，不同小獸的檢測(cè)陽(yáng)性率之間有顯著性差異(P<0.001)(表1)，證明在本次研究調(diào)查區(qū)域內(nèi)，姬鼠屬比其他小獸類(lèi)宿主更易攜帶巴爾通體。

表1 云南省小獸類(lèi)宿主動(dòng)物中巴爾通體感染情況Tab.1 Prevalence of Bartonella infection in small mammals of Yunnan

卡方檢驗(yàn)比較不同宿主間陽(yáng)性率，P<0.001，χ2=64.756.

Indicates statistically significant difference,P<0.001，χ2=64.756 by Chi-square test.

本次研究選取采樣點(diǎn)分屬于不同氣候類(lèi)型(段旭等，2011)：小中甸千湖山、千湖山、鹿馬登鄉(xiāng)、片馬鎮(zhèn)地區(qū)屬溫帶季風(fēng)氣候，該地捕獲小獸的陽(yáng)性率為10.51%(39/371)，各咱紅山與德欽升平鎮(zhèn)地區(qū)屬高寒山區(qū)，捕獲小獸的陽(yáng)性率為4.94% (4/81)，虎跳峽與福貢上帕鎮(zhèn)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，捕獲小獸的陽(yáng)性率為13.16% (5/38)，三壩納西族鄉(xiāng)與團(tuán)結(jié)村地區(qū)屬高原氣候，陽(yáng)性率為12.12% (24/298)?？ǚ綑z驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同氣候類(lèi)型間陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異，P=0.207(表2)。

本次研究采樣點(diǎn)分布于海拔1 200～4 300 m的高原山區(qū)，根據(jù)不同海拔將樣本分成4組(表3)：1 200～2 000、2 000～3 000、3 000～4 000、4 000 m以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同海拔間陽(yáng)性率分別為9.05%，13.85%，7.89%和15.07%，卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組間陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異，P=0.207。

2.3 序列分析

從本次研究所擴(kuò)增到的巴爾通體groEL基因中選取4株有代表性的序列與GenBank中12株標(biāo)準(zhǔn)序列，選擇根瘤菌(AY837546)為外群，采用MEGA5.1軟件進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用Neighbor-Joining方法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，選擇bootstrap分析，繪制重復(fù)參數(shù)設(shè)置1 000次。進(jìn)化分析表明，在云南西北部地區(qū)的小獸宿主中的巴爾通體分為兩種基因型Bartonellatribocorum、Bartonellarattimassiliensis。

結(jié)果顯示本次研究中的云南香格里拉小中甸千湖山地區(qū)捕獲的短尾鼩(編號(hào)305)、瀘水片馬鎮(zhèn)地區(qū)捕獲的灰頸鼠兔(編號(hào)417)為代表的序列與B.rattimassiliensis(AY515128)同源性達(dá)97%，屬于同一分支。而在福貢亞坪地區(qū)捕獲的中華姬鼠(編號(hào)653)中檢測(cè)的巴爾通序列與B.tribocorum(AM260525)同源性最高，達(dá)到99%。

表2 云南省不同氣候類(lèi)型小獸類(lèi)宿主動(dòng)物的巴爾通體感染率Tab.2 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different climate types

卡方檢驗(yàn)比較不同氣候類(lèi)型間陽(yáng)性率，P=0.207,χ2=3.287.

Indicates statistically no significant difference ,P=0.207,χ2=3.287 by Chi-square test.

表3 云南省不同海拔捕獲小獸類(lèi)宿主動(dòng)物的巴爾通體感染率Tab.3 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different altitude

卡方檢驗(yàn)比較不同海拔間陽(yáng)性率，P=0.219,χ2=3.243.

Indicates statistically no significant difference,P=0.219,χ2=3.243 by Chi-square test.

圖2 基于巴爾通體groEL基因部分測(cè)序結(jié)果的進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on partial groEL gene of Bartonella●：本研究所測(cè)得序列Sequence used in this study; Bartonella clarridgeiae：克氏巴爾通體；Bartonella rochalimae：羅氏巴爾通體；Bartonella henselae：漢賽巴爾通體；Bartonella quintana：五日熱巴爾通體；Bartonella doshiae：多氏巴爾通體；Bartonella birtlesii：布氏巴爾通體；Bartonella grahamii：格氏巴爾通體；Bartonella taylorii：泰氏巴爾通體。

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)巴爾通體在小獸類(lèi)宿主中的帶菌率很高，英國(guó)地區(qū)62.2%(23/27)(Birtlesetal.，1994)，美國(guó)南部42.7%(119/279)(Kosoyetal.，1997)，美國(guó)西北部33.3%(37/111)(Jacomoetal.，2002)。在我國(guó)云南地區(qū)，幾次對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物巴爾通體自然感染情況的調(diào)查研究中顯示，其平均感染率在14.1%～44.3%(白瑛等，2002; 白瑛等，2003; 栗冬梅等，2004a；栗冬梅等，2004b)。攜帶巴通體的主要宿主動(dòng)物為貓、犬、牛以及嚙齒類(lèi)，其中野生嚙齒類(lèi)的檢出率最高。本次研究中云南西北部地區(qū)小獸類(lèi)宿主的巴爾通體帶菌率為10.47%，略低于其他文獻(xiàn)報(bào)道。

以往文獻(xiàn)中未曾報(bào)道云南地區(qū)松鼠屬攜帶巴通體的報(bào)道，本研究共捕獲8只松鼠，其中6只隱紋花松鼠Tamiopsswinhoei，2只眀紋花松鼠Tamiopsmacclelland，在怒江傈僳族自治州福貢縣上帕鎮(zhèn)捕獲的隱紋花松鼠中檢測(cè)到1只攜帶巴爾通體，為云南地區(qū)松鼠屬可以在自然狀態(tài)下攜帶巴通體提供證據(jù)。

在本次研究中所捕獲的688只小獸中，各種屬中都有巴爾通體檢出，其中姬鼠屬檢出率最高(25.27%)，明顯高于其他鼠種，證明在本次研究采樣地區(qū)，姬鼠屬比其他宿主更容易攜帶巴爾通體。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，我國(guó)云南省存在巴爾通體疫源地，在疫源地內(nèi)的優(yōu)勢(shì)鼠種分別為黃胸鼠與齊氏姬鼠，而本次調(diào)查研究捕獲宿主中未見(jiàn)黃胸鼠，分析原因?yàn)楸敬尾杉睾０屋^高，大多為高原山區(qū)，而黃胸鼠主要分布于低海拔地區(qū)。本研究采樣點(diǎn)的選擇按照不同氣候類(lèi)型和海拔分組，確保采集樣品對(duì)不同類(lèi)型生境的代表性。分析不同海拔和氣候?qū)π～F類(lèi)宿主的巴爾通體帶菌率，其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在不同海拔與氣候類(lèi)型中的小獸類(lèi)宿主均存在對(duì)巴爾通體的攜帶且無(wú)選擇差異。

本研究中所檢出的巴爾通主要分為兩種基因型Bartonellatribocorum、B.rattimassiliensis，該兩種基因型的巴爾通體分布在不同的采樣點(diǎn)，在怒江傈僳族自治州檢出的巴爾通體主要為B.tribocorum型而在迪慶藏族自治州檢出的巴爾通體主要為B.rattimassiliensis型，提示在不同地區(qū)的小獸類(lèi)宿主中巴爾通的基因型存在差異，這可能與不同地區(qū)小獸的優(yōu)勢(shì)種屬不同有關(guān)。

本研究首次在云南西北部高原地區(qū)檢測(cè)小獸宿主的感染情況，對(duì)該地區(qū)的巴爾通體研究奠定了基礎(chǔ)，而且該地區(qū)主要以畜牧業(yè)為主，人們?cè)谏a(chǎn)生活中易接觸到小獸類(lèi)宿主，通過(guò)對(duì)小獸類(lèi)宿主的感染調(diào)查研究對(duì)該地區(qū)巴爾通的防治提供了重要依據(jù)。