朱小娟 郭曉霞 李春曉 汪中明 邢 丹 董言德 閻 婷 蘇建新 王 剛 張恒端 吳治明 趙彤言**

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071)

登革病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA病毒，有4個(gè)不同的血清型(DEN-1，2，3，4)，均可引起登革熱(Dengue fever, DF)、登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome, DSS)，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。通常登革2型病毒(DEN-2)的感染較其他血清型更為嚴(yán)重(Gubleretal., 1997; 秦鄂德等，2008)。近年來(lái)隨著人口流動(dòng)加大，現(xiàn)代交通旅游及國(guó)際交往增多，登革熱和登革出血熱的流行和暴發(fā)更為頻繁，全球每年有數(shù)千萬(wàn)人被感染致病，登革熱已成為一個(gè)世界性的傳染病。目前尚未有預(yù)防登革熱的疫苗和特效治療藥物。

登革病毒主要通過(guò)埃及伊蚊Aedesegypti和白紋伊蚊Ae.albopictus傳播，蚊蟲(chóng)叮咬帶病原宿主后，病毒進(jìn)入蚊體內(nèi)進(jìn)一步增殖，并通過(guò)叮咬健康宿主完成自然界的傳播循環(huán)。不同致病力的毒株在媒介宿主內(nèi)的增殖與傳播能力密切相關(guān)，準(zhǔn)確了解病毒在其宿主細(xì)胞與蚊蟲(chóng)體內(nèi)真實(shí)的增殖過(guò)程可以更好的探究病毒與媒介宿主的相互作用機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病原體在機(jī)體內(nèi)的分布，以及增殖過(guò)程中病原體含量的變化，是研究病原在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布和增殖規(guī)律與疾病發(fā)展關(guān)系非常有效的方法(Ginzingeretal., 2002，Rosinskietal., 2002)。

本研究為了解登革病毒在媒介宿主細(xì)胞及蚊蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況，精確地檢測(cè)宿主細(xì)胞、蚊蟲(chóng)體內(nèi)的病毒載量，進(jìn)而對(duì)病毒載量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。研究旨在使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)病毒感染媒介宿主細(xì)胞及自然途徑感染埃及伊蚊體內(nèi)病毒粒子復(fù)制的拷貝數(shù)進(jìn)行全程定量檢測(cè)。了解病毒感染動(dòng)力學(xué)過(guò)程，為進(jìn)一步研究登革病毒的病原特性、致病性提供實(shí)驗(yàn)資料；也可對(duì)流行病學(xué)調(diào)查提供指導(dǎo)意見(jiàn)；同時(shí)為蚊蟲(chóng)的防治及疾病控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒：DEN-2病毒NGC株(New Guinea C strain)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室提供。病毒經(jīng)1日齡乳鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)顱內(nèi)傳代，發(fā)病后取出鼠腦研磨，用DMEM(Gibco)稀釋10倍，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2細(xì)胞：白紋伊蚊C6/36細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)，用含10%小牛血清的RPIM 1640 (Gibco)高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)傳代，液氮凍存。

1.1.3蚊蟲(chóng)：埃及伊蚊實(shí)驗(yàn)室種群采自?？?在本室養(yǎng)殖多年, 吸血感染前饑餓24 h。蚊蟲(chóng)常規(guī)養(yǎng)殖的條件為：溫度25℃，相對(duì)濕度(70±10)%，每天光照：黑暗 14 h:10 h，成蚊喂食 8%糖水,羽化5 d后用于實(shí)驗(yàn)。雌蚊吸食病毒后養(yǎng)殖在28℃恒溫室內(nèi)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)小鼠：1日齡昆明乳鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.5主要試劑：RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)于GIBCO公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR master Mix、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DL-2000 DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司，pEASY-T1 simple載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于Trans公司。AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit試劑為美國(guó)Ambion公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1引物及探針設(shè)計(jì)：根據(jù)DENV的包膜蛋白基因組相對(duì)保守序列利用Primer Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針, 并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了Blast同源性比對(duì)驗(yàn)證。TaqMan探針的 5′端和3′端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)TAMER。引物和探針均由上海生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：DEN-2F(sense): 5′-AAGGAG AACCCAGCCTAAATGAA-3′;DEN-2R(anti-sense): 5′-GAACATAGCACAGGTCACAATGC-3′;TaqMan probe: FAM-TTCGTCTGCAAACACTCC ATGGTGGAC-TAMER, 理論擴(kuò)增長(zhǎng)度128 bp。

1.2.2DEN-2病毒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備：按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DEN-2病毒鼠腦懸液、正常乳鼠懸液(陰性對(duì)照)以及DEN-2病毒細(xì)胞液(陽(yáng)性對(duì)照)的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用上述引物擴(kuò)增目的基因，片段大小為128 bp，PCR反應(yīng)條為：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。而后用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接pEASY-T 1 simple載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序檢測(cè)。鑒定測(cè)序結(jié)果與原核酸序列高度同源后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，測(cè)定質(zhì)粒濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，按如下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)：質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=6.02×1023(copies/mol)×質(zhì)粒濃度(g/μL)/質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量(MWg/mol)(李慧鋒等, 2010)。

1.2.3DEN-2病毒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的熒光定量PCR方法的建立： 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋為8個(gè)濃度做為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，采用25 μL體系： 2× RT-PCR Buffer 12.5 μL、DEN-2F 0.5 μL(10 μmol/μL)、DEN-2R 0.5 μL(10 μmol/μL)、TaqMan probe 1 μL(10 μmol/μL)、25× RT-PCR Enzyme Mix 1 μL、Nuclease-free Water 4.5 μL、質(zhì)粒DNA 5 μL。反應(yīng)條件為45℃10 min，95℃10 min；95℃15 s，58℃45 s，40個(gè)循環(huán)。先進(jìn)行每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔的熒光定量PCR,計(jì)算批內(nèi)差異。然后再進(jìn)行每個(gè)濃度1個(gè)孔的熒光定量PCR，進(jìn)行3次，計(jì)算批間差異。

1.2.4DEN-2病毒感染C6/36細(xì)胞：將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。待C6/36細(xì)胞長(zhǎng)至單層后(42 h左右)，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)接種400 μL稀釋10-2DEN-2病毒液，孵育90 min后將接入的病毒液吸出，每孔加入2 mL 2%小牛血清的RPIM 1640細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，反復(fù)凍融3次，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5DEN-2病毒模擬自然途徑感染蚊蟲(chóng)： 先取1日齡的昆明乳鼠顱內(nèi)接種DEN-2病毒，病毒接種量為0.02 mL/只，將接種病毒的乳鼠置于紗窗設(shè)備的蚊籠中飼養(yǎng)，逐日觀察乳鼠發(fā)病情況。待乳鼠出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀時(shí)(病毒血癥高峰期)，將病毒血癥高峰期乳鼠置于羽化3～5 d饑餓18～24 h的埃及伊蚊小籠內(nèi)使其叮咬，吸血1 h后，-20℃凍麻，挑飽血雌蚊飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度(29±1)℃，相對(duì)濕度(75±5)%，喂以5%糖水，分別在叮咬發(fā)病鼠后1、3、5、7、9、11和13 d收集埃及伊蚊的標(biāo)本10只/組。正常鼠腦懸液做對(duì)照。

1.2.6熒光定量PCR檢測(cè)DEN-2病毒在C6/36細(xì)胞和埃及伊蚊中的動(dòng)態(tài)變化：按照RNA提取劑盒說(shuō)明書(shū)提取上述不同時(shí)間收集的細(xì)胞、蚊蟲(chóng)樣本的病毒RNA，陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，用前述建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)病毒增殖量，用儀器自帶軟件分析增殖量的動(dòng)態(tài)變化，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量RT-PCR方法的建立

目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在128 bp處可見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的大小一致(圖1)。目的擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收，連接pEASY-T 1 simple載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR和測(cè)序檢測(cè)證明擴(kuò)增的目的片段與原核酸序列同源率達(dá)到99%。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為0.215 μg/μL，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)為4.93×1010copies/μL。

圖1 病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Normal RT-PCR analysisM: DL2000；1：病毒鼠腦懸液擴(kuò)增結(jié)果；2：陰性對(duì)照；3：陽(yáng)性對(duì)照.M: DL2000; 1:Suspension of infected mouse brain; 2: Negative control; 3: Positive control.

通過(guò)熒光定量RT-PCR各條件優(yōu)化，得出檢測(cè)DEN-2病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。DEN-2病毒熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品的濃度從1×102～1×107具有良好的線性關(guān)系(R2=0.998504)，標(biāo)準(zhǔn)曲線總體斜率為-3.35。將1×108～1×102copies/μL系列梯度濃度的DEN-2標(biāo)準(zhǔn)品DNA重組質(zhì)粒先進(jìn)行每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔的熒光定量PCR，計(jì)算批內(nèi)差異；然后再進(jìn)行每個(gè)濃度1個(gè)孔的熒光定量PCR，進(jìn)行3次，計(jì)算批間差異。表1顯示，本研究建立的熒光定量PCR法檢測(cè)DEN-2標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)差異最大只有1.69%。表2顯示，熒光定量PCR法檢測(cè)DEN-2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的批間最大變異系數(shù)僅為4.21%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Real-time for DEN-2 virus

樣本SamplesDEN-2濃度/DEN-2Copies (Copies/μL)平均Ct值Mean Ct標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)CV(%)DEN-2質(zhì)粒DEN-2 plasmid1×10815.280.110.691×10717.930.090.501×10621.050.040.191×10524.570.110.451×10427.890.180.641×10330.600.511.661×10232.410.190.57

表2 DEN-2熒光定量PCR批間差異Tab.2 Results of repeated inter-batch assay of one sample

熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小為128 bp，見(jiàn)圖3。

圖3 熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 FQ-PCR analysisM:DL2000;1：1×108Copies/μL；2：1×107Copies/μL；3：1×106Copies/μL；4：1×105Copies/μL；5：1×104Copies/μL；6：1×103Copies/μL；7：1×102Copies/μL；8：陰性對(duì)照；Negative control.

2.2 DEN-2病毒感染蚊蟲(chóng)細(xì)胞

制作的蚊蟲(chóng)細(xì)胞狀態(tài)良好，培養(yǎng)48 h后換液，24 h時(shí)接入DEN-2病毒，細(xì)胞在接毒第 2 d開(kāi)始出現(xiàn)病變(CPE)，第4 d病變明顯(圖4)，第6 d細(xì)胞大量脫落。

圖4 C6/36細(xì)胞接種感染DEN-2病毒第4 d的病變結(jié)果Fig.4 C6/36 cells with cytopathic effect by inoculating with DEN-2 virus on the fourth dayA：正常C6/36細(xì)胞(對(duì)照)；B：C6/36細(xì)胞出現(xiàn)典型病變.A: Normal C6/36 cells(control); B: C6/36 cells with typical CPE.

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)DEN-2病毒在C6/36細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化

熒光定量結(jié)果如圖5所示，登革病毒感染C6/36細(xì)胞第2～6 d的病毒載量較第1、7 d的高。其中第3 d的病毒載量最高。登革病毒感染C6/36細(xì)胞2～3 d期間病毒載量變化呈上升的趨勢(shì)；3～5 d病毒載量變化并不明顯，波動(dòng)穩(wěn)定；6～7 d病毒載量變化呈下降的趨勢(shì)。

圖5 DEN-2病毒感染C6/36細(xì)胞病毒載量動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic Change of DEN-2 virus loading in infected C6/36 cells

圖6 DEN-2病毒模擬自然界感染埃及伊蚊體內(nèi)病毒載量的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic Change of DEN-2 virus loading in Aedes egypti simulate natural infection

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)DEN-2病毒模擬自然途徑下感染埃及伊蚊的動(dòng)態(tài)變化

埃及伊蚊叮咬DEN-2病毒發(fā)病鼠后的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，經(jīng) TaqMan RT-PCR檢測(cè)病毒感染的第1～13 d登革病毒核酸均呈陽(yáng)性，表明DEN-2病毒在埃及伊蚊體內(nèi)至少能存在13 d。圖6所示，感染DEN-2病毒的埃及伊蚊體內(nèi)的病毒載量值隨著時(shí)間增加呈現(xiàn)先低后高，隨后再降低再升高，最后再降低。DENV模擬自然界途徑感染的蚊蟲(chóng)體內(nèi)第1、5、9、11 d的病毒載量較第3、7、13的高，其中第9 d得病毒載量最高。

3 討論

TaqMan探針?lè)ㄊ峭ㄟ^(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)變化對(duì)目的核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。其核心是利用Taq酶的3′-5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合,所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量(Zhangetal., 2006)。國(guó)內(nèi)外已有不少實(shí)驗(yàn)室針對(duì)登革病毒基因組的不同區(qū)域，如5′ UTR(Dos-Santosetal., 2008)、衣殼蛋白(Callahan etal., 2001; Chienetal., 2006)、包膜蛋白(Itoetal., 2004; 羅招凡等，2007)、NS5(Laueetal., 1999)和3′ UTR(Houngetal., 2001; 姚錦繡等，2009；Huhtamoetal., 2010)等，采用SYBR green I染料法、分子信標(biāo)法和TaqMan探針?lè)ǖ确椒?，分別對(duì)登革病毒進(jìn)行型特異或4個(gè)型通用的定性或定量檢測(cè)，其中，又以TaqMan探針?lè)☉?yīng)用最廣。本研究針對(duì)DEN-2病毒的E基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針，采用TaqMan探針?lè)ń⒁环N監(jiān)測(cè)DEN-2病毒的熒光定量PCR方法。與病毒分離鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)和普通RT-PCR等登革病毒感染的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法相比(Shuetal.,2004)，其敏感性高,可以檢測(cè)到初始模版中1×102copies/μL的病毒核酸，特異性好，操作簡(jiǎn)便迅速。該方法的建立對(duì)臨床早期診斷及不同嚴(yán)重程度疾病患者的臨床標(biāo)本提供了一個(gè)快速、靈敏、可靠的技術(shù)工具。

本研究直接將待檢目的片段克隆到pEASY-T1 simple載體中以構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，最大限度的保證了標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)樣品間的擴(kuò)增效率一致性。通過(guò)10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系R2=0.998504，標(biāo)準(zhǔn)曲線總體斜率為-3.35。說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增效率良好，能夠保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確性，其檢測(cè)范圍較寬、靈敏度高，完全可以滿足實(shí)際應(yīng)用。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)(CV)0.19%～4.21%，表明該方法具有很好的重復(fù)性。用此標(biāo)準(zhǔn)品在優(yōu)化的濃度和體系下繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)性好、穩(wěn)定、可信。以此方法研究DEN-2病毒在細(xì)胞和蚊蟲(chóng)體內(nèi)的復(fù)制動(dòng)力學(xué)，結(jié)果可信度更高。

在本研究中，通過(guò)建立的TaqMan RT-PCR方法能夠動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)細(xì)胞與蚊體內(nèi)DENV載量的變化規(guī)律。根據(jù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)DENV載量的變化結(jié)果顯示，DENV病毒在感染細(xì)胞第2 d DENV病毒載量略微降低，第3 d即大幅上升至高峰，第4～5 d仍然與高峰時(shí)接近，而且病毒載量的處于同一數(shù)量級(jí)，但至第6～7 d時(shí)又有波動(dòng)呈下降趨勢(shì)。這可能是在細(xì)胞接種第3 d時(shí)，細(xì)胞基本呈島狀，細(xì)胞存活數(shù)目最多，釋放入上清中的DENV也最多，隨后細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層，會(huì)有部分細(xì)胞死亡，釋放入上清中的DENV會(huì)有所減少，但隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，病毒復(fù)制也在加快，因此上清中DENV含量會(huì)逐漸增加，病毒載量保持穩(wěn)定在同一數(shù)量級(jí)上，而在細(xì)胞接種第7 d時(shí)，細(xì)胞破碎大量死亡導(dǎo)致病毒載量降低。同時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)與病毒數(shù)量呈負(fù)相關(guān)性，病毒接種2 d后細(xì)胞狀態(tài)良好，第3 d細(xì)胞出現(xiàn)病變，第4 d時(shí)病變明顯，第6、7 d時(shí)細(xì)胞大量脫落。由以上結(jié)果可知，DENV病毒在接種細(xì)胞后不同時(shí)間內(nèi)病毒活性和復(fù)制能力存在一定差異，第4 d病毒狀態(tài)最佳，活性和復(fù)制能力最強(qiáng)。根據(jù)病毒在細(xì)胞水平上復(fù)制增殖的動(dòng)態(tài)規(guī)律可以確定病毒增殖的最佳時(shí)間，獲得較高滴度的病毒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)良的病毒。

同樣，在登革病毒感染的蚊蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)中，隨著時(shí)間增加感染DEN-2病毒的埃及伊蚊體內(nèi)的病毒載量值隨著時(shí)間增加呈現(xiàn)先低后高，隨后再降低再升高，最后再降低，表明病毒在蚊體內(nèi)發(fā)生了增殖。DENV在蚊蟲(chóng)第1～7 d內(nèi)增殖不明顯，第9 d DENV開(kāi)始大量復(fù)制，蚊蟲(chóng)體內(nèi)的病毒載量達(dá)到高峰，但第11～13 d后有所下降至穩(wěn)定。這表明DENV病毒9 d后在蚊蟲(chóng)體內(nèi)開(kāi)始快速增殖，外潛伏期約為9 d，到11～13 d后蚊蟲(chóng)體內(nèi)病毒增殖穩(wěn)定波動(dòng)。因此繪制的病毒增殖曲線全程真實(shí)地反映了DEN-2病毒在其媒介蚊蟲(chóng)體內(nèi)的增殖動(dòng)態(tài)。這一研究為蚊蟲(chóng)體內(nèi)病毒的復(fù)制能力及病毒載量的高低與致病機(jī)理提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

迄今為止，實(shí)時(shí)定量PCR方法大多數(shù)應(yīng)用于登革病毒早期快速診斷，對(duì)登革病毒在媒介體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)未見(jiàn)報(bào)到。鑒于媒介體內(nèi)病毒的動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)是控制登革熱疾病的一個(gè)重要方面，本研究選用DEN-2病毒在細(xì)胞和蚊蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制增殖實(shí)驗(yàn)。從個(gè)體細(xì)胞和整體感染研究了登革病毒復(fù)制的動(dòng)態(tài)變化，揭示了病毒在細(xì)胞和蚊蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制增殖的動(dòng)態(tài)規(guī)律。掌握登革病毒在細(xì)胞和蚊蟲(chóng)體內(nèi)的復(fù)制情況對(duì)監(jiān)測(cè)登革病毒水平傳播、毒力演變有重要意義?？傊?實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)為深入研究病毒與宿主的相互作用提供了可行的技術(shù)平臺(tái)。并以此確定最優(yōu)感染體系。