婁 強 張 薇 劉廣超 馬遠方

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院河南省抗體藥物工程實驗室細胞與分子免疫重點實驗室，開封475004)

T細胞的充分活化需要雙信號刺激，第一信號由TCR/CD3識別抗原提呈細胞(Antigen presenting cell，APC)表面的抗原肽-MHC復(fù)合物啟動，第二信號由T細胞和APC間共刺激分子的相互作用啟動，其中B7/CD28是最重要的協(xié)同刺激分子。單獨的CD3抗體刺激會使T細胞失能;單獨的CD28抗體也不能刺激T細胞活化［1，2］。聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體研究人類和小鼠T細胞體外活化的方法一直被廣泛應(yīng)用。雖然許多細胞表面受體可以通過TCR增強信號，但CD28的確比其他共刺激分子更加有效。已有報導(dǎo)聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體刺激人外周血單個核細胞(PBMC)，使其在體外得到擴增活化［3］，并且CD28共刺激能明顯加強CD3誘導(dǎo)的小鼠脾臟T細胞的增殖，使IL-2的分泌量上調(diào)，并誘導(dǎo)T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多種基因的mRNA發(fā)生變化［4］。已知不同濃度的CD3單抗和CD28單抗、刺激的不同時間等因素均對人T淋巴細胞的增殖產(chǎn)生影響，第一信號(CD3單抗)呈濃度依賴性地促使T淋巴細胞增殖，濃度達到峰值(12.5 μg/ml)后，再加大濃度也不能使其作用增加;第二信號(CD28單抗)則表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié)，高于或低于最佳濃度都使其刺激T細胞增殖的水平降低。T細胞單獨接受抗CD3抗體24小時或抗CD28抗體16小時后，T細胞對相應(yīng)的另一信號刺激呈低反應(yīng)性［5］。聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體對T淋巴瘤細胞活化影響的模式有待進一步探索。

EL4屬于小鼠T淋巴瘤細胞系，來源于由9，10-二甲基-1，2苯并蒽誘生的C57/BL/6N小鼠T淋巴瘤細胞，曾應(yīng)用于H-2抗體和CD3抗體共刺激T細胞活化的研究［6］。EL4細胞分為 PMA敏感型和PMA抵抗型，PMA抵抗型EL4細胞能夠分泌IL-2，而PMA敏感型EL4細胞不分泌IL-2。評價T細胞活化最重要的因素即為細胞分泌IL-2的水平，因此可以應(yīng)用PMA敏感型EL4細胞研究T細胞活化的模式。在本研究中，我們將從IL-2及細胞核轉(zhuǎn)錄因子的分泌、細胞增殖與細胞周期三個方面分析EL4細胞的活化能力。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 小鼠淋巴瘤細胞EL4(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)為懸浮生長，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)加入10%無支原體胎牛血清FBS(浙江天杭生物科技有限公司)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。維持細胞濃度在0.1×106～1×106個/ml之間，2～3天換液一次。

1.2 EL4細胞的活化及其細胞因子IL-2的誘生96孔酶標(biāo)板放入超凈臺中紫外照射半個小時以上。將抗CD3(sc-18871，Santa cruz)和 CD28抗體(sc-12727，Santa cruz)用PBS稀釋至不同濃度包被其中，4℃過夜，將抗體吸出，PBS洗一遍，拍干孔內(nèi)液體，加入EL4細胞 (2×105個/200 μl)，PMA 組無需包被，將PMA(50 ng/ml)直接加入到細胞培養(yǎng)液中即可，37℃、5%CO2培養(yǎng) 24、48、72 小時分別收集細胞培養(yǎng)上清。

1.3 EL4細胞分泌IL-2水平的ELISA檢測 按Mouse IL-2 sunnyELISA試劑盒(購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)說明測定IL-2的含量。準(zhǔn)備所有的試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品，洗液洗板兩次，浸泡板條15分鐘，每孔加入50 μl樣本稀釋液，15分鐘內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和對照品，加入50 μl檢測抗體，室溫孵育3小時，洗板6次，加入100 μl過氧化物酶，室溫孵育45分鐘，洗板6次，加入100 μl顯色底物，避光，室溫孵育10～30分鐘，加入100 μl終止液，30分鐘內(nèi)，在450 nm波長檢測OD值。Varloskan Flash多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001)測定EL4細胞培養(yǎng)上清中IL-2的含量。

1.4 細胞增殖實驗 按細胞增殖與毒性檢測試劑盒7Sea-CCK-8(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)說明測定EL4細胞活化前后增殖情況。細胞的活化方法同上，此時加入IL-2單克隆抗體(sc-34797，Santa cruz)刺激組(50 μg/ml)。每孔接種4 000個細胞(200 μl/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24、48、72 小時后，每孔加入20 μl 7Sea-CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～4小時，用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.5 細胞周期實驗 按細胞周期與凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)說明檢測CD3/CD28抗體或PMA刺激對EL4細胞周期的影響。1 000 r/min離心5分鐘沉淀細胞后，用1 ml預(yù)冷的PBS重懸，再用1 000 r/min離心5分鐘沉淀細胞，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻，4℃固定過夜，1 000 r/min離心5分鐘沉淀細胞后，用1 ml預(yù)冷的PBS重懸，再用1 000 r/min離心5分鐘沉淀細胞，加入碘化丙啶染色液0.5 ml，輕輕混勻重懸細胞，37℃避光溫育30分鐘后，上流式細胞儀檢測。

1.6 RNA的提取 收集細胞，加入1 ml Trizol(Invitrogen)，充分混勻用來破碎細胞，加入三氯甲烷(洛陽昊華化學(xué)試劑廠)200 μl，15～30℃放置2分鐘，13 000 r/min，4℃離心15分鐘。取上清加入無水乙醇1 ml，混勻，13 000 r/min，4℃離心15分鐘，棄上清。加入75%酒精(DEPC水配制)1 ml，洗滌離心10分鐘，傾去上清，用吸水紙吸干殘余酒精，加入約50 μl DEPC水混勻，58℃ 10分鐘，加入 DNA裂解酶，37℃ 15分鐘，75℃ 5分鐘，最后加入RNA酶抑制劑(康為世紀(jì))，紫外分光光度計(DU640，Beckman Coulter)測RNA的濃度。

1.7 cDNA的合成 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀(jì))RNA 模板 1 ng ～ 5 μg，5 × RT buffer 4 μl，0.1 mol/L，DTT 2 μl，dNTP mix(10 mmol/L)1 μl，隨機引物(100 μmol/L)1 μl，super RT(200 U/μl)1 μl，無RNA酶 DEPC水補足至總體系為20 μl。42℃、50分鐘，70℃、15分鐘，紫外分光光度計測cDNA的濃度，置－20℃或－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 Real time PCR反應(yīng) 將 cDNA樣品稀釋為200 ng/μl加入 1 μl，2 × SYBR Green Real time PCR Master Mix(TOYOBO)10 μl，10 × Plus 溶液 2 μl，上下游引物(均為 10 μmol/L)2.4 μl，RNase-Free water 4.6 μl，每管 20 μl反應(yīng)體系，每個樣品 3 個復(fù)孔。置于實時定量PCR儀(corbett research RG-6000)進行PCR反應(yīng)，設(shè)置程序為:95℃ 5秒，55℃10秒，72℃ 15秒，擴增40個循環(huán)，收集熒光。計算每組每個基因的ΔCt，再按公式:ΔΔCt=ΔCt(組2)－ΔCt(組1)，計算兩組中每個基因的 ΔΔCt，通過 2－ΔΔCt計算組2與組1對應(yīng)基因的表達差異。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD3/CD28抗體在不同濃度及不同時間點刺激EL4分泌IL-2水平(pg/ml)比較 小鼠淋巴瘤細胞EL4在未受到任何刺激的情況下分泌IL-2的水平很低，經(jīng)抗CD3(25 μg/ml)抗體和抗CD28(2 μg/ml)抗體刺激48小時后，EL4分泌IL-2的水平顯著升高(62.54 ±2.19)pg/ml，P ＜0.05，見表1。

2.2 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體對EL4細胞增殖的影響 采用CCK-8法觀察了CD3/CD28抗體對EL4細胞增殖的影響。CD3/CD28抗體作用于EL4細胞至72小時時，隨著CD3/CD28抗體濃度的增加，對細胞增殖的促進作用逐漸增強。同時加入IL-2抗體并不影響EL4細胞的增殖(圖1)。

表1 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體對EL4細胞分泌IL-2(pg/ml)的影響Tab.1 Influence of combined application of CD3/CD28 monoclonal antibody on IL-2(pg/ml)secreted by EL4 cells

圖1 IL-2抗體及聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體對EL4細胞增殖的影響Fig.1 Effect of IL-2 antibody and combined application of CD3/CD28 monoclonal antibody on EL4 cell proliferation

2.3 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體對EL4細胞周期的影響 CCK-8法顯示EL4細胞經(jīng)過CD3/CD28抗體刺激后，增殖能力顯著增加(P＜0.05)，進而通過流式細胞儀檢測CD3/CD28抗體對EL4細胞周期的影響。CD3/CD28抗體刺激組與未刺激組相比，EL4細胞周期未出現(xiàn)明顯的G1期阻滯(圖2)。

圖2 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體對EL4細胞周期的影響Fig.2 Effect of combined application of CD3/CD28 monoclonal antibody on EL4 cell cycle

圖3 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體對EL4細胞IL-2及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，NF-AT表達的影響Fig.3 Effect of combined application of CD3/CD28 monoclonal antibody on the expression of IL-2 and nuclear transcription factors NF-κB， NF-AT in EL4 cells

2.4 聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體刺激對EL4細胞IL-2及核轉(zhuǎn)錄因子基因表達影響的定量分析 為探討CD3/CD28抗體介導(dǎo)的IL-2調(diào)節(jié)的分子機制，在EL4細胞培養(yǎng)體系中聯(lián)合加入抗CD3/CD28單克隆抗體，通過競爭性PCR定量檢測其對IL-2 mRNA及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和 NF-AT的影響。結(jié)果表明，抗CD3/CD28抗體可明顯促進 IL-2、NF-κB和 NF-AT mRNA 合成(P ＜0.05，圖3)。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)包被CD3/CD28抗體于細胞培養(yǎng)板上刺激T淋巴瘤EL4細胞活化的效果比在培養(yǎng)液中加入可溶性CD3/CD28抗體更明顯。這可能是由于EL4細胞接觸的包被CD3/CD28抗體有限，從而更容易刺激細胞增殖;并且，包被CD3抗體可能使EL4細胞表面CD3分子交連，使其胞內(nèi)區(qū)互相靠近，胞內(nèi)區(qū)的ITAM(免疫受體酪氨酸活化基序)易于被蛋白酪氨酸激酶(PTK)磷酸化，進而刺激EL4細胞的活化。CD3抗體通過激活多種蛋白酪氨酸激酶，再經(jīng)一系列信號傳遞激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達，使細胞活化［7］。CD28通過 PI3K、Grb2、A-SMase、PKC-θ等多種信號分子傳遞活化信號，亦可通過Itk、MPK等傳導(dǎo)活化抑制信號，從而調(diào)控T細胞的活化、增殖等作用。已知多種細胞因子參與T細胞增殖和分化過程，包括IL-2、NF-AT、NF-κB 等［8，9］，未激活 T 細胞僅表達低親和力 IL-2R，而激活的T細胞可表達高親和力IL-2R并分泌IL-2。通過自分泌及旁分泌作用，IL-2與T細胞表面IL-2R結(jié)合，介導(dǎo)T細胞增殖和分化［10，11］。我們發(fā)現(xiàn)CD3/CD28單克隆抗體共刺激EL4細胞明顯增加IL-2及核轉(zhuǎn)錄因子的表達，為進一步評價EL4細胞作為研究T細胞活化的模型細胞提供了重要的參考價值，也對T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究有重要意義。

聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單克隆抗體活化人PBMC［12］、人T細胞、小鼠脾臟細胞及EL4細胞等不同的細胞需要抗體刺激的濃度不同，這可能與細胞對抗原提呈細胞提呈不同抗原反應(yīng)的能力不同有關(guān)。如果游離的CD3單抗?jié)舛冗^大，可能導(dǎo)致由CD3抗體導(dǎo)致的CD3受體交連后傳遞抑制信號，細胞結(jié)合過多CD3抗體不但不會刺激T細胞，而且會導(dǎo)致細胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用CD3單抗或者CD28單抗刺激EL4細胞后，不能顯著促進IL-2的分泌，而聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單抗能夠明顯刺激EL4細胞分泌IL-2。EL4細胞經(jīng)過CD3/CD28抗體刺激后，增殖能力顯著增加，而細胞周期卻不受明顯影響，這可能是因為EL4細胞本身屬于無限增殖狀態(tài)的細胞系，其不需要成熟為分化完全的細胞，也不需要參與免疫應(yīng)答。

本研究中應(yīng)用的小鼠T淋巴瘤EL4細胞株自身不分泌作為T細胞活化標(biāo)志的IL-2，與原代T細胞相比不需要細胞分離分選等提取過程，可以更方便的應(yīng)用于體外T細胞的活化的研究;另外，EL4細胞在未受到任何刺激的情況下分泌IL-2的水平很低，經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28抗體刺激后，分泌IL-2的水平顯著升高，所以認(rèn)定未經(jīng)抗體刺激的EL4細胞為非活化的T細胞，為T細胞體外增殖活化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究提供了細胞模型。

1 Abe R，Vandenberghe P，Craighead N et al.Distinct signal transduction in mouse CD4+and CD8+splenic T cells after CD28 receptor ligation［J］.J Immunol，1995;154(3):985-997.

2 Sansom D M，Wilson A，Boshell M et al.B7/CD28 but not LFA-3/CD2 interactions can provide‘third-party’co-stimulation for human T-cell activation［J］.Immunology，1993;80(2):242-247.

3 Garlie N K，LeFever A V，Siebenlist R E et al.T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer［J］.J Immunother，1999;22(4):336-345.

4 周俐斐，陳峰陽，李曉譽et al.CD3/CD28共刺激調(diào)節(jié)T細胞多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因mRNA表達［J］.中國免疫學(xué)雜志，2012;28(5):393-414.

5 王順友，孫 雨，馬寶驪.抗CD3、CD28單抗對人T淋巴細胞共刺激作用的影響因素［J］.上海免疫學(xué)雜志，1999;19(4):229-231.

6 Brams P，Claesson M H.T-cell activation.I.Evidence for a functional linkage between class I MHC antigens and the Tc-Ti complex［J］.Immunology，1989;66(3):348-353.

7 Cantrell D.T cell antigen receptor signal transduction pathways［J］.Annual Review Immuno，1996;14:259-274.

8 Northrop J P，Ho S N，Chen L et al.NF-AT components define a family of transcription factors targeted in T-cell activation［J］.Nature，1994;369(6480):497-502.

9 Livolsi A，Busuttil V，Imbert V et al.Tyrosine phosphorylation-dependent activation of NF-kappa B.Requirement for p56 LCK and ZAP-70 protein tyrosine kinases［J］.Eur J Biochem，2001;268(5):1508-1515.

10 Waldmann T A.The IL-2/IL-2 receptor system:a target for rational immune intervention ［J］.Immunology Today，1993;14(6):264-270.

11 Cantrell D A，Smith K A.The interleukin-2 T-cell system:a new cell growth model［J］.Science，1984;224(4655):1312-1316.

12 駱 群，呂 明，于 鳴et al.抗CD28抗體協(xié)同刺激增強抗CD3抗體體外激活T淋巴細胞并降低TGF-β的表達［J］.中國實驗血液學(xué)雜志，2006;14(3):547-551.