朱翠明 陳蘇芳 余敏君 游曉星 唐雙陽 吳移謀

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽421001)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，一年四季都可發(fā)病，但大多數(shù)發(fā)生于夏末秋初，以5～15歲的青少年發(fā)病率最高，占兒童肺炎的10% ～30%，流行期間可達(dá)30% ～50%［1，2］。Mp 感染多用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，但近年來耐藥菌株不斷增多，給臨床治療帶來困難［3，4］。因此研制有效的疫苗預(yù)防Mp感染十分必要。

對Mp疫苗滅活疫苗、減毒活疫苗和菌體成分疫苗的研究效果均不理想［5］。核酸疫苗在體內(nèi)表達(dá)的抗原具有天然的空間構(gòu)象，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，是近年來研究熱點(diǎn)。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)P1蛋白羧基端的第1 125～1 395位氨基酸(P1C蛋白)具有較強(qiáng)的免疫原性，其所誘生的抗體能阻止Mp對細(xì)胞的粘附，是研究Mp疫苗的理想候選分子［6］。并構(gòu)建了P1C核酸疫苗，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用［7，8］。

白細(xì)胞介素2(Interleukin-2，IL-2)是一種最常用的細(xì)胞因子免疫佐劑，能顯著增強(qiáng)疫苗的免疫效果［9］，我們實驗室也發(fā)現(xiàn)IL-2對梅毒螺旋體、人乳頭瘤病毒和幽門螺桿菌核酸疫苗有良好的佐劑效應(yīng)［10-12］。本研究將p1c基因和IL-2基因聯(lián)合構(gòu)建在同一真核細(xì)胞表達(dá)載體上，肌注免疫 BALB/c小鼠，檢測其所誘發(fā)的免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用，了解IL-2對P1C核酸疫苗的免疫佐劑效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 Mp M129株(ATCC 29342)、pcDNA3.1(+)(縮寫為 pcD)、pcDNA3.1(+)/IL-2(縮寫為 pIL-2)、pcDNA3.1(+)/P1C(縮寫為pP1C)由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存;SP4液體和固體培養(yǎng)基為Oxoid產(chǎn)品;去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自Qiagen;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)購自Santa Cruz;小鼠IFN-γ和IL-4定量檢測試劑盒購自R＆D Systems。

1.1.2 實驗動物 BALB/c鼠由武漢大學(xué)實驗動物中心提供，南華大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 Mp的培養(yǎng) 將Mp M129菌株轉(zhuǎn)種至20 ml SP4培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)5～7天至培養(yǎng)基顏色由紅變黃后棄上清，加入2 ml SP4培養(yǎng)基，收獲燒瓶底部的Mp，其濃度約108～109菌落形成單位［(Colony-Forming unit，CFU)/ml，CFU/ml］。

1.2.2 核酸疫苗的構(gòu)建 以本研究所保存的pP1C為模板，設(shè)計引物，并在其下游引物中引入一個Linker基因:GATCCCCGGGTACCGAGC(編碼Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Ser)，用上游引物 p1c-F 5'-GGGGATCCATGACGGACTTTGTCAAACC-3'和下游引物 p1c-Linker-R 5'-GATCCCCGGGTACCGAGCCCCATCTAACAGTTCAGC-3'擴(kuò)增得到 p1c-Linker基因;以 pIL-2質(zhì)粒為模板，用上游引物L(fēng)inker-IL-2-F 5'-GCTCGGTACCCGGGGATCTACAGGATGCAACTCC-3'和下游引物IL-2-R 5'-GGAATTCCTAGTTTTCCATACTGAT-3'擴(kuò)增Linker-IL-2基因;然后以擴(kuò)增得到的p1c-Linker基因和Linker-IL-2基因為模板，p1c-F和IL-2-R為引物擴(kuò)增p1c-IL-2基因。將純化的p1c-IL-2基因和pcD質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切、T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli XL-1 Blue感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/ml氨芐西林的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)篩選陽性克隆。并通過PCR、酶切、測序鑒定。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，無菌PBS稀釋至 2 μg/μl備用。

1.2.3 免疫接種 將125只4～6周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組，每組免疫25只小鼠;在各組小鼠左后腿股四頭肌分別注射50 μl PBS、pcD、pIL-2、pP1C或pP1C-IL-2。分別于第0、14和28天進(jìn)行3次免疫。

1.2.4 抗感染實驗 小鼠初次免疫后第56天，用乙醚麻醉小鼠，誘導(dǎo)過度通氣，在每只小鼠處于吸氣相時向其鼻孔內(nèi)滴入50 μl含有2×107CFU的Mp菌液，正常對照組以等量的SP4培養(yǎng)基滴鼻接種。

1.2.5 樣本的收集 在小鼠初次免疫后第56天和Mp 攻擊后第1、3、6、9、12 天，分別摘取眼球放血處死小鼠，將收集的血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存于－80℃?zhèn)溆?。肺組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后用蘇木蘇和伊紅(H＆E)染色，進(jìn)行肺組織炎癥病理評分(Histopathologic score，HPS)。

1.2.6 ELISA 融合重組蛋白rP1C的制備見文獻(xiàn)［6］。將1 μg純化的rP1C 4℃包被酶標(biāo)板過夜，次日用含0.05%Tween 20的 PBS洗3次后用0.3%的BSA 4℃封閉過夜。將100 μl 1∶50稀釋的小鼠血清或1∶4稀釋的BALF加入酶標(biāo)板，37℃孵育1小時后用PBST洗滌4次，再加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a或 IgA，37℃孵育30分鐘后用PBST洗滌4次，在各反應(yīng)孔中加入顯色劑 TMB與 H2O2各50 μl，37℃避光孵育10分鐘，最后每孔加入50 μl 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取OD450值。根據(jù)試劑盒說明書，檢測小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4的含量，兩種細(xì)胞因子試劑盒的最低檢測量為4 pg/ml。

1.2.7 Mp菌落計數(shù) 將25 μl系列倍比稀釋的BALF接種至SP4固體培養(yǎng)基，37℃ 95%N2和5%CO2氣體條件下，培養(yǎng)5～7天，低倍鏡下計數(shù)Mp菌落數(shù)，用log10CFU/ml表示，本實驗最低菌落檢出率數(shù)為40 CFU/ml。

1.2.8 肺組織病理評分 Mp感染各組小鼠后，用雙盲法請組織病理學(xué)者根據(jù)文獻(xiàn)［13］用肺組織病理學(xué)評分系統(tǒng)對各組BALB/c鼠肺組織進(jìn)行炎癥評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運(yùn)用SPSS16.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)之間的比較采用單因素ANOVA分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 真核重組質(zhì)粒鑒定 pP1C-IL-2重組質(zhì)粒雙酶切后用瓊脂糖凝膠電泳可見約5.4 kb和1 300 bp的兩個條帶，其大小與線性化的pCD質(zhì)粒和p1c-IL-2基因片段相符。以pP1C-IL-2為模板，p1c-F和IL-2-R為引物擴(kuò)增的得到一約1 300 bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。測序鑒定表明獲得陽性重組體。

2.2 P1C特異性抗體和抗體亞類 P1C-IL-2和P1C核酸疫苗免疫后56天所產(chǎn)生血清總IgG、IgG1和IgG2a亞類均較PBS、pcD和pIL-2對照組顯著增高(P＜0.001)，P1C-IL-2融合疫苗組血清中 IgG、IgG1和IgG2a與P1C單基因疫苗相比，差異有顯著性(P＜0.05)，且IgG2a較IgG1的增高更顯著。各免疫組BALF中SIgA抗體水平差異無顯著性(P＞0.05，圖2)。

2.3 IFN-γ和IL-4水平 P1C-IL-2疫苗組和 P1C疫苗組小鼠支氣管灌洗液中IFN-γ和IL-4水平均較對照組顯著增高，且P1C-IL-2疫苗組小鼠IFN-γ和IL-4水平與P1C免疫組小鼠差異有顯著性(P＜0.001 和 P ＜0.05，圖3)。

圖1 pP1C-IL-2重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pP1C-IL-2 by endonuclease digestion and PCR

2.4 肺組織病理改變和評分 Mp感染后第1、3、6天，與P1C疫苗組小鼠相比，P1C-IL-2核酸疫苗組小鼠的肺間質(zhì)炎癥病變區(qū)域較擴(kuò)散，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤增多，HPS明顯增高(P＜0.05)，而與 PBS、pCD、pIL-2對照組差異無顯著性(P ＞0.05，圖4)。第9、12天P1C-IL-2核酸疫苗免疫組小鼠的HPS與P1C疫苗免疫組差異無顯著性(P＞0.05)，且兩組HPS均低于對照組(P＜0.05，圖4)。用SP4培養(yǎng)基做對照攻擊的小鼠HPS為0～1分。

2.5 Mp攻擊后各免疫組小鼠Mp菌落計數(shù) 用Mp 經(jīng)呼吸道感染免疫小鼠，1、3、6、9、12 天后 P1CIL-2和P1C疫苗組小鼠BALF中Mp菌落數(shù)均低于對照組(P＜0.05)。與P1C核酸疫苗組比較，P1C-IL-2融合基因疫苗組小鼠第1、3、6天 BALF中Mp菌落數(shù)明顯減少(P＜0.05)，但第9、12天兩組 Mp菌落數(shù)差異無顯著性(圖5)。

圖2 血清IgG及亞類和支氣管灌洗液IgA檢測(n=5)Fig.2 The levels of total antibody，IgG isotypes and BALF IgA of anti-P1C from immunized mice(n=5)

圖3 各免疫組小鼠支氣管灌洗液中IFN-γ和IL-4水平(n=5)Fig.3 ELISA analysis of IFN-γ and IL-4 levels in BALF(n=5)

圖4 Mp感染后各組肺組織病理評分(n=4)Fig.4 The HPS in the lung tissues of each group of mice inoculated with M.pneumoniae(n=4)

圖5 Mp攻擊后各免疫組小鼠支氣管肺泡灌洗液菌落計數(shù)(n=4)Fig.5 BAL fluids colonization by M.pneumoniae after respiratory challenge with M.pneumoniae(n=4)

3 討論

Mp為胞外寄生的病原體，其免疫主要是體液免疫。抗體對控制Mp感染有重要的作用，中和抗體能阻止Mp對呼吸道黏膜上皮細(xì)胞的粘附而阻止感染，IgG還能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用并阻止Mp向肺泡擴(kuò)散［14］。實驗結(jié)果顯示，IL-2能增強(qiáng)P1C疫苗免疫后的總IgG以及IgG1和IgG2a亞類水平，表明IL-2能促進(jìn)P1C疫苗誘發(fā)的系統(tǒng)體液免疫應(yīng)答。

SIgA能阻止Mp感染呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，是黏膜局部抗感染免疫最重要的抗體。P1C-IL-2融合疫苗免疫組和P1C單基因疫苗免疫組小鼠支氣管灌洗液中的SIgA與對照組差異均無顯著性，這表明經(jīng)肌注免疫后，IL-2不能促進(jìn)P1C核酸疫苗免疫后黏膜局部SIgA的分泌。

目前越來越多的研究表明，體液抗體對Mp感染的保護(hù)作用不完全。Mp可侵入宿主的組織細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)增殖，引起持續(xù)性感染［14］，導(dǎo)致腦膜腦炎、心肌炎、腎炎、動脈粥樣硬化、冠心病等肺外感染和并發(fā)癥。細(xì)胞免疫，尤其是CD4+Th1型細(xì)胞免疫對清除胞內(nèi)持續(xù)感染的 Mp非常重要［15，16］。CD4+Th1細(xì)胞主要通過分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)，其中IFN-γ是一種至關(guān)重要的抗Mp感染的細(xì)胞因子，呼吸道黏膜局部IFN-γ的缺失可導(dǎo)致Mp的菌落數(shù)增高、肺組織炎癥加重［17］。實驗發(fā)現(xiàn) IL-2能促進(jìn)P1C疫苗免疫后支氣管灌洗液中IFN-γ的水平，顯著增強(qiáng)P1C疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫。

為檢測疫苗的免疫保護(hù)作用，實驗對各免疫組小鼠感染Mp早期和晚期肺間質(zhì)炎癥進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在Mp感染1～6天，P1C-IL-2疫苗免疫組小鼠的肺組織病理炎癥較P1C組加重，這可能是由于P1CIL-2疫苗激發(fā)的免疫應(yīng)答過強(qiáng)，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)超敏反應(yīng)性炎癥［18］。這種超敏反應(yīng)性炎癥可能與IL-2作為佐劑促進(jìn)P1C疫苗分泌高水平的IL-4相關(guān)。研究表明，IL-4基因敲除小鼠感染Mp后，肺組織中支原體數(shù)量少于正常感染小鼠，肺組織炎癥病理損傷減輕。因此IL-4的產(chǎn)生非但不能產(chǎn)生免疫保護(hù)，還可引起超敏反應(yīng)性，加重肺組織炎癥［17］。在感染9天后，疫苗免疫組小鼠的肺組織炎癥較對照組減輕，這可能是由于疫苗激發(fā)的免疫保護(hù)效應(yīng)所致。

用Mp攻擊各免疫組小鼠，病原學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)P1C-IL-2雙基因融合疫苗免疫小鼠感染后第1、3、6天支氣管灌洗液中Mp的菌落數(shù)較P1C單基因疫苗免疫組小鼠顯著減少，說明IL-2能增強(qiáng)P1C核酸疫苗的抗Mp感染作用。

綜上所述，IL-2雖可顯著增強(qiáng)P1C核酸疫苗的免疫保護(hù)作用和免疫應(yīng)答水平，但在感染早期也誘發(fā)了較重的肺組織病理炎癥。在后續(xù)研究中，我們將通過改變疫苗接種策略，如改變接種途徑、減少疫苗接種劑量等進(jìn)一步研究IL-2對P1C核酸疫苗的免疫佐劑作用。

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