龐曉楠，李 慧，李鐵臣

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.分子生物學(xué)研究室;2.機能學(xué)實驗中心，安徽 蕪湖 241002)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期特有的對胎兒危害較大的肝內(nèi)疾病，會導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)或者死胎，其發(fā)病機制目前尚不清楚［1-2］。據(jù)相關(guān)文獻報道ABCB4基因的突變可能與ICP的發(fā)生有一定的關(guān)系［1，3］。本實驗采用PCR結(jié)合DNA序列測定的方法，通過分析15例ICP患者ABCB4基因外顯子8(exon 8，E8)的突變情況，探討其與ICP的發(fā)病是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 納入實驗的ICP患者參照以下診斷標準:孕晚期出現(xiàn)皮膚瘙癢、黃疸等不適;血清膽酸或血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平顯著增高;排除其他能引起瘙癢、黃疸和肝功能異常的疾?。?］。本實驗的研究對象是2010年10月～2012年1月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院的15例ICP住院患者。年齡23～30歲，平均(26.2±2.29)歲。所有入選病例均于產(chǎn)前抽取外周血2～3 ml，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常規(guī)酚-氯仿法抽提所收集的ICP患者外周血，制備成DNA標本于4℃條件下保存、備用。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)設(shè)計E8的上下游引物用于PCR擴增，引物序列在NCBI網(wǎng)站經(jīng)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)驗證無誤后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

E8的上游引物序列為:5'-ATAGCCATCAGTAAAGGG-3'，下游引物序列為:5'-AAAGGGTTGACCAGAGTG-3'，產(chǎn)物大小 340 bp，退火溫度65℃。PCR 總反應(yīng)體積為 50 μl:模板 DNA 2 μl，Taq 酶2.5 U，10 × buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各 0.5 μl，加 ddH2O 至總體積 50 μl。

PCR試驗過程在PTC-150型PCR儀(美國MJ公司產(chǎn)品)上完成，循環(huán)的具體過程為:98℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，在此過程運行至20 s時加入Taq酶(Promega公司產(chǎn)品);65℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，共33個循環(huán)，最后72℃延伸4 min。取10 μl PCR擴增產(chǎn)物加樣，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30～60 min(電壓 100V)，溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色，生物電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-200A)下觀察結(jié)果，將所得PCR產(chǎn)物于4℃條件下保存。

1.2.3 DNA的測序 使用DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司產(chǎn)品)對PCR產(chǎn)物進行純化回收。將純化后的PCR產(chǎn)物以及E8的上游引物寄至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，返回的測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比對。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 15例ICP患者DNA標本的PCR擴增結(jié)果如下圖所示，均擴增出目的片段，片段大小為340 bp(見圖1)。

圖1 ABCB4基因外顯子8的PCR產(chǎn)物M:100 bp DNA Ladder Marker;1-11:ICP病例標本PCR產(chǎn)物Fig 1 PCR products of ABCB4 gene exon 8M:100 bp ladder DNA marker;1-11:PCR products of ICP patients

2.2 DNA序列測定結(jié)果 將15例ICP患者ABCB4基因外顯子8的測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比對驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有5例存在ABCB4基因外顯子8的c.711A＞T雜合性突變(見圖2、3)。

圖2 ABCB4基因外顯子8未發(fā)現(xiàn)突變測序圖Fig 2 Sequence of ABCB4 gene exon 8 indicates absence of mutation

3 討論

ICP的首發(fā)癥狀是瘙癢，一般主要發(fā)生在妊娠晚期，發(fā)生于中期和早期的頻率依次降低;大約有30%的患者可以檢測到γGT水平的升高;該疾病的主要風(fēng)險是會導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒窘迫［5］。目前普遍認為ICP與性激素、遺傳以及環(huán)境因素有關(guān)，具有明顯的家族性、種族性和地域性，但其發(fā)病機制尚不明確［6］。

圖3 ABCB4基因外顯子8 c.711A＞T雜合性突變測序圖Fig 3 Sequence of ABCB4 gene exon 8 indicates c.711A＞Theterozygous

ABCB4基因也稱多藥耐藥基因3(multidrug resistance 3，MDR3)，位于染色體 7q21.1，基因全長約74 kb，共有27個外顯子［3］。其編碼的 P糖蛋白是一種ATP依賴性藥物排出泵，屬于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族，該P糖蛋白輸出的磷脂酰膽堿可以保護膽管免受膽汁鹽的損傷［7］。若ABCB4基因突變導(dǎo)致編碼的糖蛋白丟失或者功能喪失，則膽道內(nèi)磷脂濃度的降低，缺乏磷脂的膽汁成分可能導(dǎo)致膽管受損、膽石沉積，誘發(fā)炎癥并進一步導(dǎo)致各種肝臟疾?。?］。

1999年，Jacquemin等［9］首次證明了 ABCB4基因突變與ICP相關(guān)。國外的文獻報道稱ABCB4基因的突變熱點主要涉及外顯子 6、9、12、14、23［10］。本實驗室曾對ABCB4基因的外顯子6、12、14、23進行了研究，并未發(fā)現(xiàn)點突變［11-12］。劉玉凌等［13］采用PCR-SSCP的方法對30例中國ICP患者ABCB4基因的外顯子6、9、12、14、23 進行研究，結(jié)果亦未見異常。綜合以上研究報道，我們推測由于妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)病存在地域和種族的差異，中國的ICP患者可能存在其他ABCB4基因的突變熱點。Wasmuth等［14］認為ABCB4基因外顯子8的c.711A＞T突變現(xiàn)象是瑞典人群中ICP重癥患者發(fā)病的危險因素。為了探討中國人群中ICP患者中是否存在外顯子8的突變現(xiàn)象，本實驗采用PCR和DNA序列測定的方法，對15例ICP患者ABCB4基因外顯子8進行序列測定，發(fā)現(xiàn)其中5例存在c.711A＞T雜合性突變。這一發(fā)現(xiàn)提示，該位點的突變可能與中國人群中ICP的發(fā)病有一定的關(guān)聯(lián)。

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