郝 偉，楊解人，張俊秀，李文星，劉 艷

(皖南醫(yī)學院 藥理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

高血壓在我國的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率高、致死、致殘率亦高，可累及多處靶器官。左心室肥厚是高血壓最常見的器官損害之一，也是心血管疾病的獨立危險因素。左心室肥厚包括可導致心室壁張力增加，各種心律失常、并易發(fā)生心肌梗死、腦卒中甚至猝死。因此，防止和逆轉(zhuǎn)左心室肥厚是當前治療高血壓病的主要目標之一。

復方山菊是由野菊花、羅布麻葉、淫羊藿及鉤藤組成的新型復方制劑(由蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院提供)。其中野菊花具有降壓、保護心臟、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化、抗免疫作用［1］。羅布麻葉能夠降壓、降脂，抗氧化、抗衰老，保肝、改善心臟功能［2］。淫羊藿具有降壓、降低血小板和紅細胞聚集反應、延長凝血酶原時間，降低全血粘度，抑制血栓形成，抗氧化、抗衰老作用［3］。鉤藤具有降壓、抗心律失常、抑制血小板聚集［4］等作用。臨床上發(fā)現(xiàn)將上述4種中藥組成復方制劑能很好的降低高血壓病人的血壓，我們在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)上也證明口服復方山菊能夠明顯的降低血壓、血脂、全血粘度及血尿酸［5－6］，減輕 SHR腎小球損傷，減少其系膜區(qū)膠原纖維沉積［7］等作用。但是對SHR心臟是否有保護作用，為何有保護作用均未見報道，故本試驗選用SHR連續(xù)灌藥16周，觀察復方山菊對心臟的保護作用及可能機制，為臨床用藥提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性16周齡SHR 35只，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠7只，體質(zhì)量(300±50)g，許可證號:SCXK(滬)2007-0005(上海斯萊克動物有限公司)。顆粒飼料(南京青龍山動物試驗中心)。大鼠自然光照，自由進食飲水，室溫(23±2)℃，相對濕度60% ～65%。

1.2 藥物和試劑 復方山菊，每粒含藥0.1 g，相當于1.5 g生藥，批號090314(蕪湖市中醫(yī)院提供);卡托普利片批號09102411(常州制藥廠有限公司);HE染色劑:蘇木精，伊紅;MASSON染液試劑盒(南京建成生物工程研究所);免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 分組及給藥 復方山菊成人每日用量為0.4 g(4粒)，按60 kg計算，折算成大鼠等效量(按千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù))為0.047 g/kg，以0.05 g/kg為等效量(低劑量組)，按倍遞增為0.15 g/kg(中劑量組)，0.45 g/kg(高劑量組)，卡托普利(0.03 g/kg)陽性對照組，每組7只。另設WKY正常對照組(蒸餾水5 ml/kg)7只。按上述設定劑量，每日下午5時灌胃給藥(容積為5 ml/kg)，每日1次，連續(xù)16周。

1.4 HE染色和MASSON染色 末次給藥后，3%戊巴比妥鈉(10 ml/kg)麻醉，取左心室心肌，濾紙拭干。10%甲醛固定、包埋、切片、HE染色，光鏡觀察心肌組織病理學改變。MASSON染色(具體步驟參照試劑盒說明書)心肌組織切片，光鏡下觀察心肌組織膠原纖維的表達。

1.5 免疫組化法表達心肌 TGF-β1、c-fos和 iNOS蛋白 心肌組織石蠟橫斷面切片，厚度約4 μm/片，常規(guī)脫蠟至水，染色程序嚴格按照試劑盒步驟進行，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片觀察。實驗步驟參照試劑盒說明書。

結(jié)果判定:TGF-β1、c-fos、iNOS 均定位于心肌細胞的胞漿內(nèi)。陽性呈黃至棕黃色。所有染色切片在同一條件下采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析，測定其平均積分光密度值(AIOD)，陽性表達水平用AIOD(±s)表示，AIOD越大，TGF-β1、c-fos、iNOS 表達水平愈高;反之則表達水平愈低。

2 結(jié)果

2.1 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織形態(tài)學的影響 光鏡下，WKY大鼠心肌細胞排列整齊，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，未見心肌纖維破壞，細胞質(zhì)豐富且均勻，細胞核形態(tài)正常，細胞間隙正常。與WKY組比較，SHR組心肌細胞增生肥大且排列紊亂，細胞核增大深染，有的核周圍可見空泡性病變，心肌細胞間隙增寬，組織中可見大量的炎性細胞浸潤，說明SHR心肌細胞具有病理損傷，當給不同劑量的復方山菊后，心肌纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，炎性細胞浸潤減少，說明心肌細胞的病理損傷得到不同程度的改善。提示復方山菊具有保護心肌細胞損傷，改善心肌纖維重構(gòu)的作用(圖1)。

2.2 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌膠原纖維的影響 MASSON染色顯示，心肌細胞為紅色，膠原纖維為藍色，WKY組心肌細胞間隙清晰可見，心肌間質(zhì)旁膠原分布稀疏，著色較淺。與WKY組比較，SHR心肌間質(zhì)和血管旁有明顯藍色深染，說明SHR心肌間質(zhì)和血管旁纖維組織明顯增多且排列紊亂，伴有嚴重的膠原沉積。與SHR組比較，隨著復方山菊劑量的增加，心肌間質(zhì)和血管旁的藍色深染逐漸減少，膠原沉積現(xiàn)象逐漸減輕，說明復方山菊對SHR心肌間質(zhì)膠原沉積有一定的改善作用(圖2)。

2.3 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌TGF-β1蛋白表達的影響 免疫組化圖像分析顯示，TGF-β1主要表達于心肌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。與WKY比較SHR心肌TGF-β1蛋白顯著增多，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);與SHR比較，復方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg 劑量組和 Cap 組心肌 TGF-β1表達顯著減少，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，說明復方山菊可下調(diào)SHR心肌TGF-β1蛋白的表達(圖3)。

2.4 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌c-fos蛋白表達的影響 免疫組化圖像分析顯示，c-fos主要表達于心肌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。與WKY比較SHR心肌c-fos蛋白顯著增多，具有顯著統(tǒng)計學差異(P ＜0.01);與SHR 比較，復方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg劑量組和Cap組心肌c-fos表達顯著減少，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，說明復方山菊可下調(diào)SHR心肌c-fos蛋白的表達(圖4)。

圖1 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織形態(tài)學的影響(400×)Fig 1 Effect of compound shanju on myocardium in SHR by morphology results(HE×400)

圖2 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌膠原纖維的影響(400×)Fig 2 Effect of compound shanju on myocardial collagen fibres in SHR(400×)

圖3 復方山菊對SHR心肌TGF-β1表達的影響(±s，n=7)Fig 3 Effect of compound shanju on the protein expression of TGF-β1 in myocardium of SHR

圖4 復方山菊對SHR大鼠心肌c-fos表達的影響(±s，n=7)Fig 4 Effect of compound shanju on expression of protein c-fos in myocardium of SHR

2.5 復方山菊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌iNOS蛋白表達的影響 免疫組化圖像分析顯示，iNOS主要表達于心肌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。與WKY比較SHR心肌iNOS蛋白顯著增多，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);與SHR比較，復方山菊0.45 g/kg、0.15 g/kg劑量組和Cap組心肌iNOS表達顯著減少，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，說明復方山菊可下調(diào)SHR心肌iNOS蛋白的表達(圖5)。

圖5 復方山菊對SHR大鼠心肌iNOS表達的影響(±s，n=7)Fig 5 Effect of compound shanju on expression of protein iNOS in myocardium of SHR

3 討論

本實驗研究結(jié)果顯示，SHR心肌細胞增生肥大且排列紊亂，細胞核增大深染，有的核周圍可見空泡性病變，心肌細胞間隙增寬，組織中可見大量的炎性細胞浸潤，心肌間質(zhì)和血管旁纖維組織明顯增多且排列紊亂，伴有嚴重的膠原沉積，說明SHR心肌細胞具有病理損傷。經(jīng)復方山菊16周治療后，SHR心肌纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，炎性細胞浸潤減少，心肌間質(zhì)和血管旁的藍色深染逐漸減少，膠原沉積現(xiàn)象逐漸減輕，表明復方山菊對SHR心肌損傷具有改善作用。

那么復方山菊是通過何種機制來保護心臟的?文獻報道，高血壓時RAAS系統(tǒng)被激活，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)增多，AngⅡ可直接引起心肌間質(zhì)成纖維細胞的增殖，細胞外基質(zhì)(ECM)組成成分如粘連素、層粘蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型膠原等的合成增多［8］，并抑制ECM降解酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，抑制ECM的降解。此外，AngⅡ還可以刺激心肌成纖維細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)，TGF-β1可刺激其細胞外基質(zhì)蛋白的合成［9］，抑制膠原降解，促進心肌肥大、心肌細胞表型改變。本次實驗結(jié)果顯示復方山菊高、中劑量組的心肌TGF-β1蛋白比SHR組顯著下降，說明復方山菊可以通過下調(diào)心肌TGF-β1蛋白的表達，從而減少心肌膠原沉積，改善心肌的纖維化。

AngⅡ還可通過興奮AT1受體激活c-fos而引起細胞功能活動［10］。c-fos屬即早基因，可編碼多種核內(nèi)多種信息因子，對細胞分化、增殖起重要作用［11］。實驗證明高血壓左心室肥厚的形成和發(fā)展與心肌組織內(nèi)原癌基因c-fos密切相關［12］。因此，很多學者將c-fos視為AngⅡ心肌肥厚的標志物［13］。進一步研究顯示復方山菊高、中劑量組的心肌c-fos蛋白比SHR組顯著下降，說明復方山菊可以通過下調(diào)心肌c-fos蛋白的表達，防止心肌細胞肥大，左心室肥厚。

此外，高血壓時不僅RAAS系統(tǒng)被激活而導致了AngⅡ的增加，同時iNOS和ROS的產(chǎn)生也增多。iNOS可以進一步增加AngⅡ，而ROS則可以激活NF-κB，活化的NF-κB一方面可以增強心肌細胞的反應，另一方面通過促使iNOS的生成，更進一步地增加AngⅡ的含量，而大量的AngⅡ刺激心肌成纖維細胞產(chǎn)生過多的TGF-β1，促進心肌細胞原癌基因c-fos的表達增加，二者均可以引起心肌細胞增殖肥大，促使重構(gòu)。iNOS的生物活性不依賴Ca2+鈣調(diào)蛋白，當心肌肥厚時，在許多炎性因子的刺激下，心肌細胞可發(fā)生iNOS高度表達，后者可誘導產(chǎn)生大量的NO［14］，NO通過誘導心肌凋亡及使心肌細胞外基質(zhì)金屬蛋白水解酶活性增加，促進心肌重構(gòu)，加重心功能損傷［15］。本實驗研究結(jié)果顯示SHR經(jīng)復方山菊治療16周后，心肌iNOS蛋白表達明顯低于SHR組，說明復方山菊可通過下調(diào)SHR心肌iNOS蛋白的表達，抑制心肌細胞的凋亡從而促進細胞外基質(zhì)的降解。

綜上所述，復方山菊具有減少心肌膠原沉積，減輕心肌細胞病理損傷，逆轉(zhuǎn)左心室肥厚，保護心臟的作用。其機制可能與下調(diào)心肌TGF-β1、c-fos及iNOS蛋白表達有關。

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