潘彩明，沈群山，黃后寶，蔡張愉，王 嘯，姜書傳，董昌斌

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 泌尿外科，安徽 蕪湖 241001)

關(guān)于抗癌藥物抑制膀胱腫瘤的動(dòng)物研究，目前多以建立某品系大鼠的膀胱腫瘤模型，再運(yùn)用藥物進(jìn)行灌注，以觀察抗癌藥的抑癌效果，其中動(dòng)物模型的建立以MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤的模型較為穩(wěn)定。華蟾素系中藥大蟾蜍皮的水制劑，有研究表明運(yùn)用華蟾素對(duì)大鼠膀胱腫瘤行灌注治療，有一定的抗癌作用［1］，同時(shí)還能刺激骨髓增生，且華蟾素毒副作用較小，但與臨床常用的膀胱灌注藥物相比，其療效如何，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是否有一定的抑制作用，其相關(guān)研究較少，故本實(shí)驗(yàn)主要觀察華蟾素灌注大鼠膀胱與常用預(yù)防膀胱癌的灌注藥物如卡介苗、阿霉素相比療效是否有差異;觀察華蟾素膀胱灌注對(duì)SD大鼠的膀胱腫瘤的生長(zhǎng)是否有干預(yù)影響。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只SD雌性大鼠，實(shí)驗(yàn)中大鼠周齡為3～15周，體質(zhì)量150～350 g，由江蘇南京青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，編號(hào)為［SCXK(蘇)2007-0001］。

1.1.2 主要試劑 MNU購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，劑量為5mg/支(批號(hào):20100525);BCG由上海生物制品研究所提供，劑量為 50mg/支(批號(hào):200707001);ADM購(gòu)自汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治原藥有限公司，劑量為10mg/支(批號(hào)070901);華蟾素購(gòu)于安徽金蟾生化股份有限公司。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)分組及灌注 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)分組，詳見表1。

表1 動(dòng)物分組及灌注劑量Tab 1 Animal grouping and the dosage of perfusion

1.3 藥物灌注方法 向SD大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥液，劑量按20 mg/kg換算。用碘伏液消毒其尿道外口，選用5 cm硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，先排空尿液，再使用胰島素注射器向每只大鼠膀胱內(nèi)注入相對(duì)應(yīng)藥液0.2 ml。BCG液以20 ml生理鹽水配制成 2.5 mg/ml，BCG 一次劑量 0.5 mg，約為3 mg/kg，與臨床使用的較高濃度相當(dāng)(按成人體質(zhì)量50 kg計(jì)算，劑量為150 mg/次);華蟾素濃度為1 mg/ml，由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)(序貫法)得出灌注0.2 mg，即每只用量0.2 ml;ADM每次灌注劑量是0.2 mg，與臨床使用的濃度一致。

1.4 標(biāo)本采集與組織病理學(xué)檢查 所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于灌注完成1周后處死，將膀胱完整切除，膀胱組織用10%甲醛液進(jìn)行固定，行HE染色檢查，觀察SD大鼠的膀胱腫瘤的致瘤率及其病理分級(jí)，同時(shí)觀察腹內(nèi)臟器，并每組隨機(jī)選取10只SD大鼠的其他臟器(卵巢、肝臟、脾、腎臟等)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。所有切片由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行病理分級(jí)、分期檢查(參考人類UICC、TNM系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn))，分組信息未提供給病理科醫(yī)師。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。各組數(shù)值采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中A組大鼠毛色、生長(zhǎng)、飲食、活動(dòng)等情況均良好，B組大鼠一般情況較差，C、D、E組大鼠生長(zhǎng)、飲食等情況較B組大鼠稍好，均未觀察到明顯血尿和便血，A組實(shí)驗(yàn)過程中死亡1只大鼠。

2.2 大體觀察 A組膀胱體積較小，壁薄，多數(shù)膀胱壁黏膜光滑，血管清晰，無潰瘍、充血、新生物等征象;少數(shù)膀胱壁黏膜充血，局部可見腫物，偶有結(jié)石樣鈣化，雙側(cè)腎臟及其他臟器未見粟粒樣結(jié)節(jié)。B組膀胱體積較大，壁厚，黏膜表面絕大多數(shù)可見腫物，大小不等，有的腫物呈菜花狀表現(xiàn)。C、D、E組膀胱壁表面可見多發(fā)的米粒狀、乳頭狀或結(jié)節(jié)狀腫物，體積較B組小。各組其他臟器和組織均未見腫瘤。

2.3 組織病理學(xué)檢查 光鏡觀察A組大鼠14只大鼠均未見異常增生，絕大多數(shù)切片上皮細(xì)胞排列整齊;B組13只大鼠發(fā)生膀胱移行細(xì)胞癌，細(xì)胞層次增多，排列紊亂，有病理核分裂相，局部區(qū)域或多個(gè)區(qū)域乳頭狀增生(圖1);C組6只大鼠發(fā)生膀胱移行細(xì)胞癌;D組7只大鼠發(fā)生膀胱移行細(xì)胞癌;E組5只大鼠發(fā)生膀胱移行細(xì)胞癌;C組、D組及E組三者病理類型相似(圖2～4)。各組之間癌變率的比較見表2(χ2=20.060，P ＜0.05)。SD 大鼠的其他臟器(卵巢、肝臟、脾、腎臟等)組織病理學(xué)檢查未見異常。

表2 各組大鼠膀胱腫瘤致瘤率的比較Tab 2 Comparison of the incidence rate of bladder cancer in rats in diffrent groups

圖1 MNU組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 1 Pathological image of tumor tissue for MNU group(HE×100)

圖2 華蟾素組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 2 Pathological image of tumor tissue for cinobufagin injection group(HE×100)

圖3 ADM組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 3 Pathological image of tumor tissue for ADM group(HE×100)

圖4 BCG組腫瘤組織病理圖像(HE×100)Fig 4 Pathological image of tumor tissue for BCG group(HE×100)

3 討論

華蟾素是我國(guó)傳統(tǒng)生物藥材中華大蟾蜍皮經(jīng)科學(xué)方法提取、加工制成的水溶性制劑，其主要有效成分為吲哚生物堿和蟾蜍毒素等。近年來，隨著對(duì)華蟾素的藥理作用和臨床應(yīng)用的深入研究，已證實(shí)了華蟾素具有抗病毒、抗腫瘤、止痛、強(qiáng)心、促進(jìn)骨髓增生、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，尤其是具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用［2－3］，使得華蟾素在抗腫瘤方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)Cino具有一定的抗腫瘤活性且相對(duì)毒性低，用藥安全，能有效抑制DNA和 RNA 的合成，干擾細(xì)胞的代謝［4－5］。劉祥勝等［6］研究證實(shí)Cino能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2，增強(qiáng)了T淋巴細(xì)胞的免疫能力，從而提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。Cino還具有抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)和刺激免疫系統(tǒng)的作用［7］，顯示Cino是理想的抗癌生物制劑。華蟾素雖有抗腫瘤活性，但由于具有相對(duì)的毒性，特別是心肌毒性［8］;在靜脈使用時(shí)也有不良反應(yīng)，其中以血管刺激導(dǎo)致疼痛和藥物過敏反應(yīng)較為多見;少數(shù)患者還會(huì)出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱、粒細(xì)胞減少等［9］。另外，臨床上使用華蟾素注射液的多為患有惡性腫瘤的老年患者，身體基礎(chǔ)情況又較差，致使許多患者長(zhǎng)期使用華蟾素注射液靜脈內(nèi)治療難以耐受。

有研究提示，華蟾素局部運(yùn)用于大鼠膀胱腫瘤的灌注治療，有一定的抗癌作用。本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)SD大鼠膀胱腫瘤過程中，選用華蟾素和臨床上常用的膀胱灌注藥物阿霉素、卡介苗等藥物，與誘導(dǎo)致癌物MNU交替行灌注治療，灌注結(jié)束一周后處死大鼠，病理結(jié)果提示運(yùn)用華蟾素灌注的大鼠，其腫瘤的發(fā)生率與阿霉素組、卡介苗組相似，且華蟾素組大鼠的毛色、生長(zhǎng)、飲食、活動(dòng)等一般情況均較阿霉素組、卡介苗組為佳。林宇等［10］試驗(yàn)表明:華蟾素大劑量靜脈注射和腹腔注射試驗(yàn)(靜脈給藥和腹腔注射給藥的最大耐受量分別大于或等于50.0 g/kg、62.5 g/kg)也提示華蟾素?zé)o明顯的毒性反應(yīng);卡介苗及阿霉素的毒副作用相對(duì)較多，已經(jīng)在臨床上得到證實(shí)，與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果一致。因此提示:華蟾素能有效地拮抗或抑制MNU誘導(dǎo)膀胱腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，其抑制效果與臨床上常用的灌注藥物阿霉素、卡介苗效果相類似，且未發(fā)現(xiàn)有大鼠不適表現(xiàn)，提示華蟾素運(yùn)用于膀胱癌的預(yù)防灌注較阿霉素、卡介苗的前景更有優(yōu)勢(shì)。華蟾素的抗膀胱腫瘤的可能作用機(jī)制［11－12］如下:①抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖;②具有免疫調(diào)節(jié)的功能;③顯著增強(qiáng)了大鼠單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能及體液免疫功能，可有效增強(qiáng)繼發(fā)性免疫功能低下小鼠的細(xì)胞免疫作用。但華蟾素抑制腫瘤生成的具體機(jī)制尚要進(jìn)一步研究，對(duì)華蟾素能否在臨床運(yùn)用于膀胱腫瘤的灌注治療也仍需要按臨床試驗(yàn)路徑進(jìn)一步觀察。

［1］李建昌，柳建軍，凌生濤.華蟾素對(duì)SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(8):726 －728.

［2］梁平，蒙富斌，王洪乾.華蟾素配合放療治療鼻咽癌近期療效觀察［J］.中國(guó)癌癥防治雜志，2009，1(2):148 －150.

［3］QI FANGHUA，LI ANYUAN，ZHAO LIN，et al.Cinobufacini，an aqueous extract from Bufo bufogargarizans Cantor，induces apoptosis through a mitochondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Ethnopharmacol，2010，128(3):654 － 661.

［4］KERR JF，WYLLIE AH，CURRIE AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239 － 257.

［5］MIRKES PE.2001 Warkany lecture:to die or not to die，therole of apoptosis in normal and abnormal mammalian development［J］.Teratology，2002，65(5):228 －239.

［6］劉祥勝，劉開俊，楊業(yè)金.華蟾素對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)和小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響［J］.免疫學(xué)雜志，2005，21(3):132－135.

［7］張靜.華蟾素聯(lián)合化療治療晚期惡性腫瘤療效分析［J］.腫瘤，2000，20(5):381.

［8］齊剛，張莉，何文彤，等.Bufalin的急性毒性研究［J］.武警醫(yī)院學(xué)報(bào)，2004，1(1):10 －11.

［9］李冶武，王黎玲.華蟾素注射液不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析［J］.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2010，10(4):93 －94.

［10］林宇，付鑒，陳曉偉，等.華蟾素對(duì)肺癌抗癌作用的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(1):69 －70.

［11］王雙雙，李柏，翟笑楓，等.華蟾素注射液抗腫瘤應(yīng)用及其機(jī)制研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32(5):436 －438.

［12］程文寧，肖家全.華蟾素抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(8):1193 －1194.