黃 銳，劉 敏，熊克仁

(皖南醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

在我國(guó)分布著各類毒蛇，眼鏡蛇就是其中的一種，對(duì)人生命造成一定的威脅。眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇毒腺分泌的一種毒蛋白，化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種毒理和藥理效應(yīng)。TRN是位于丘腦前外側(cè)面的一個(gè)核團(tuán)，與感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和邊緣系統(tǒng)等活動(dòng)密切相關(guān)［1］。c-fos基因?qū)儆诩纯淘缙诨颍瑓⑴c細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化、信息傳導(dǎo)、學(xué)習(xí)以及記憶等功能［2］。我室曾報(bào)道眼鏡蛇毒對(duì)TRN c-fos的表達(dá)有上調(diào)作用［3］。c-jun基因也屬于即刻早期基因家族，與c-fos關(guān)系密切［4］。c-jun在眼鏡蛇毒作用下表達(dá)如何，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討眼鏡蛇毒對(duì)大鼠TRN c-jun表達(dá)的影響，為探討眼鏡蛇毒中毒機(jī)制提供相關(guān)的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛇毒 眼鏡蛇毒(干毒)，由安徽黃山市屯溪毒蛇養(yǎng)殖研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠18只，由皖南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，雌雄不拘，體質(zhì)量230～270 g。隨機(jī)分為正常組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組，每組6只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 眼鏡蛇毒組大鼠右后肢常規(guī)消毒后，將生理鹽水與干粉狀眼鏡蛇毒按3∶1比例稀釋，于大鼠右后肢下部按0.5 μl/kg肌肉注射;生理鹽水組于同一部位注入等量生理鹽水;正常對(duì)照組大鼠不作任何處理。觀察30 min，待蛇毒組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、焦躁、嗆咳、呼吸急促伴哮鳴音或濕性啰音等明顯中毒癥狀時(shí)，將3組大鼠同時(shí)處死，用100 ml生理鹽水和300 ml 4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，取大鼠腦TRN節(jié)段在4%多聚甲醛固定液中于4℃冰箱固定24 h后取出，流水沖洗30 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明及浸蠟，包埋制成蠟塊。石蠟切片，片厚5 μm，切片入二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水，依次進(jìn)入下列各步驟:3%H2O2室溫(24～28℃)封閉7 min，在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中行微波修復(fù)，自然冷卻，滴加正常山羊血清封閉液在恒溫箱中孵育 1h，不洗，滴加 c-jun抗體(1∶1 200)，4℃冰箱過(guò)夜。第2天取出，于恒溫箱中復(fù)溫1 h，滴加生物素化羊抗兔IgG于恒溫箱中2 h，滴加鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)液于恒溫箱中1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。恒溫箱溫度均設(shè)定在37℃。最后經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后行中性樹(shù)膠封片，晾干，光鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及圖像處理 每組選取相同部位切片進(jìn)行觀察，以王平宇的大鼠腦切片圖譜為參照，采用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及平均灰度值測(cè)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05作為判定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒對(duì)TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均灰度值的影響 正常組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組大鼠TRN均可見(jiàn)c-jun陽(yáng)性細(xì)胞。c-jun陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，主要為胞漿著色，著色較均勻。生理鹽水組與正常組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及平均灰度值相比較無(wú)明顯改變(P＞0.05);眼鏡蛇毒組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)度與生理鹽水組和正常組相比均顯著增高(P＜0.01)，平均灰度值顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1和圖2。

表1 各組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值(±s，n=6)Tab 1 The number of c-jun positive cells and the average gray value in TRN for each group of rats(±s，n=6)

表1 各組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值(±s，n=6)Tab 1 The number of c-jun positive cells and the average gray value in TRN for each group of rats(±s，n=6)

注:兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間字母不同P＜0.05，字母相同P ＞0.05

組別 細(xì)胞數(shù)(個(gè)/10×40倍視野)平均灰度值正常組 24.60 ±2.46a 127.27 ±5.51a 0.000 0.000生理鹽水組 22.80 ±2.39a 132.30 ±2.18a眼鏡蛇毒組 43.60 ±2.32b 103.90 ±8.72b F 值 139.43 37.19 P值

2.2 眼鏡蛇毒對(duì)TRN不同形態(tài)c-jun陽(yáng)性細(xì)胞的影響 三組大鼠TRN均可見(jiàn)圓形、橢圓形、梭形及三角形等多種形態(tài)的c-jun陽(yáng)性細(xì)胞。生理鹽水組細(xì)胞形態(tài)與正常組相比無(wú)明顯改變(P＞0.05);眼鏡蛇毒組圓形、橢圓形、梭形細(xì)胞數(shù)量比生理鹽水組及正常組明顯增多(P＜0.01)，三角形細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯改變(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1和圖2。

表2 各組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)(±s，n=6)Tab 2Morphology of c-jun positive cells in TRN for each group of rats(±s，n=6)

表2 各組大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)(±s，n=6)Tab 2Morphology of c-jun positive cells in TRN for each group of rats(±s，n=6)

注:兩兩比較采用q檢驗(yàn)，兩組間字母不同P＜0.05，字母相同P＞0.05

0.000 0.000 0.000 0.562 3.60 ±0.70生理鹽水組 7.30 ±0.82a 6.40 ±0.70a 5.50 ±0.53a 3.50 ±0.97眼鏡蛇毒組 15.00 ±0.67b 13.00 ±0.82b 11.60 ±0.70b 4.00 ±0.82 F 值 181.94 121.93 177.23 0.60 P值組別 圓形 橢圓形 梭形 三角形正常組 8.00 ±0.82a 7.40 ±0.84a 5.70 ±0.67a

圖1 大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色法，×200)A:正常組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 1 C-jun positive cells in TRN of rats(Immunohistochemistry technique，×200)A:control group;B:saline group;C:N.atra venom group

圖2 大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色法，×400)A:正常組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組Fig 2 C-jun positive cells in TRN of rats(Immunohistochemistry technique，×400)A:control group;B:saline group;C:N.atra venom group

3 討論

眼鏡蛇毒中含有神經(jīng)毒素和細(xì)胞毒素，可導(dǎo)致細(xì)胞溶解、神經(jīng)細(xì)胞信息傳導(dǎo)阻滯，從而影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。即刻早基因普遍存在于中樞神經(jīng)細(xì)胞中，在生理情況下少表達(dá);在病理情況下，如疼痛、腦缺血、癲癇、電刺激等傷害性刺激情況下可致cjun在腦相關(guān)區(qū)域中呈一過(guò)性、廣泛、快速的表達(dá)［5］。c-jun參與c-fos對(duì)靶基因的調(diào)控過(guò)程，在神經(jīng)細(xì)胞信息傳導(dǎo)中起著重要作用。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到外界刺激后，興奮性氨基酸或NMDA受體等第一信使被激活，導(dǎo)致CaM、Ca2+、IP3、cAMP等第二信使進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而快速誘導(dǎo)c-jun和c-fos轉(zhuǎn)錄，使其細(xì)胞漿中的mRNA數(shù)量快速增加，翻譯出的Fos和Jun蛋白進(jìn)入胞核內(nèi)并形成異源二聚體Fos-Jun復(fù)合物，與基因中的AP-1調(diào)節(jié)位點(diǎn)緊密結(jié)合，從而進(jìn)一步激活靶基因，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)改變［6－7］。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到傷害性刺激時(shí)，可導(dǎo)致cjun基因的表達(dá)改變。有研究表明在周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)再生反應(yīng)，并伴隨c-jun基因表達(dá)增強(qiáng)，提示c-jun在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)以及改善神經(jīng)細(xì)胞的存活方面發(fā)揮著極為重要的作用［8－9］。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察到眼鏡蛇毒組TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞的增多，推測(cè)cjun可能有助于減少蛇毒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的損傷，保護(hù)和修復(fù)部分受損的神經(jīng)細(xì)胞，完善神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)在高倍視野下觀察到TRN主要以圓形、橢圓形和梭形c-jun陽(yáng)性細(xì)胞者居多，眼鏡蛇毒組上述三種形態(tài)的c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，提示眼鏡蛇毒主要對(duì)大鼠TRN圓形、橢圓形和梭形的c-jun陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)有影響，其機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

TRN是位于內(nèi)囊和外髓板兩者之間的一薄層神經(jīng)細(xì)胞，它接受來(lái)自板內(nèi)核群和大腦皮質(zhì)投射來(lái)的纖維，并發(fā)出纖維至丘腦各核團(tuán)，繼而再投射至大腦皮質(zhì)，形成丘腦-皮質(zhì)環(huán)路。有報(bào)道表明c-fos、c-jun基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與痛覺(jué)傳導(dǎo)密切相關(guān)［10］。本室曾報(bào)道眼鏡蛇毒可使延髓中神經(jīng)元型一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)增強(qiáng)［11］。注射眼鏡蛇毒對(duì)大鼠是一種傷害性刺激，在傷害性刺激條件下，一氧化氮(NO)可誘導(dǎo)c-fos基因的快速表達(dá)［12］，而c-jun和c-fos的表達(dá)是偶聯(lián)的，c-fos基因產(chǎn)物Fos蛋白必須與c-jun轉(zhuǎn)錄mRNA編碼的Jun蛋白結(jié)合，才能發(fā)揮其生物學(xué)作用［13］。本實(shí)驗(yàn)觀察到在注射眼鏡蛇毒后大鼠TRN c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示可能通過(guò)NO作為第二信使，介導(dǎo)c-fos、c-jun基因的表達(dá)，從而在傷害性信息的傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而TRN是否作為傷害性信息傳向大腦皮質(zhì)通路中的中繼性核團(tuán)，還有待深入研究。

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