毛 勇，毛 健，李華鐘，孟祥勇

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

雙孢菇（Agaricus bisporus）又稱為洋蘑菇，白蘑菇。在分類上屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，同擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬[1-3]。雙孢菇不僅營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)肥厚、味道鮮美，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、核苷酸和不飽和脂肪酸，具有很高的醫(yī)療保健作用，可以延年益壽，保持青春活力[4-5]。目前主要以野外采集和人工栽培為主[6-7]，但是其生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)，占地面積大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，同時(shí)受季節(jié)等因素的影響，這些都影響和制約了雙孢菇的生產(chǎn)和開發(fā)利用；與人工栽培相比，通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雙孢菇菌絲體[2，8-9]，具有菌絲增殖速度快、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)的影響、生產(chǎn)效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。多糖作為一類天然大分子化合物，來源廣泛，存在于植物、微生物（細(xì)菌和真菌）及海藻中。其中微生物多糖的重要生物活性功能已得到越來越多人的重視，具有免疫調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老、降血糖等功能，其中真菌多糖的生物活性已得到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的證實(shí)。但是，目前對(duì)雙孢蘑菇胞外多糖的報(bào)道較少[10]，僅有對(duì)雙孢菇的其他功能性成分進(jìn)行相關(guān)研究。本文將利用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基[11-13]組成來提高深層雙孢菇胞外多糖的產(chǎn)量，為以后的發(fā)酵和放大實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇（Agaricus bisporus MJ-0811） 為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；馬鈴薯、玉米漿 市購(gòu)；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O 分析純；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂 上海信然生物技術(shù)有限公司；PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然，用做食用菌斜面培養(yǎng)；種子培養(yǎng)基 葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，玉米漿15g，水1000mL，pH自然。

PHB-4型酸度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；SIGMA型高速離心機(jī) 美國(guó)SIGMA公司；LS-B50型立式圓形壓力蒸汽滅菌 上海醫(yī)用核子儀器廠；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司；5L全自動(dòng)發(fā)酵罐 Bioengineering AG。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 將活化的斜面菌種分割成大小約0.5cm2的小塊，取一小塊接種到液體種子培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量50mL培養(yǎng)基，置于旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床上，160r/min、25℃培養(yǎng)3d供各種實(shí)驗(yàn)用。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng) 將成熟種子按10%接種量轉(zhuǎn)接入500mL三角瓶中，于25℃、150r/min搖床培養(yǎng)4d。

1.2.1.3 發(fā)酵罐培養(yǎng) 采用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝料系數(shù)為0.7，接種量為10%，發(fā)酵罐培養(yǎng)溫度為25℃、初始pH5.0，通氣量0.9vvm，攪拌轉(zhuǎn)速120r/min。

1.2.3 胞外多糖的提取和測(cè)定 發(fā)酵液經(jīng)6000r/min離心10min后得上清液，再將上清液濃縮，然后加入3倍體積95%乙醇，劇烈攪拌，4℃沉淀過夜。沉淀過夜后，6000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用60℃熱水溶解，溶液于50℃經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原來體積的1/3。然后以料液比1∶5（v∶v）加入氯仿-戊醇（5∶1，v∶v），混合物振搖30min，使蛋白質(zhì)與氯仿-戊醇生成凝膠物而分離，3000r/min離心10min，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。重復(fù)多次直至兩相交界處無變性蛋白質(zhì)。然后將樣品進(jìn)行冷凍干燥，即為胞外粗多糖。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 碳源、氮源、無機(jī)鹽的篩選及單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 碳源的篩選 在含碳量相同條件下，分別考察葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖作為碳源，比較發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量；根據(jù)資料及前期實(shí)驗(yàn)，選擇葡萄糖濃度為10、20、30、40、50、60g/L，考察葡萄糖濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3.1.2 氮源的篩選 在含氮量相同條件下，分別考察豆餅粉、酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨作為氮源，比較發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量；根據(jù)資料及前期實(shí)驗(yàn)，選擇蛋白胨濃度為1、2、3、4、5、6g/L，考察蛋白胨濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3.1.3 無機(jī)鹽的篩選 在添加量相同的條件下，分別考察KH2PO4、Mg2SO4、CaCl2、FeSO4、NaCl對(duì)發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量的影響；根據(jù)資料及前期實(shí)驗(yàn)，選擇KH2PO4濃度為1、2、3、4、5、6g/L，考察KH2PO4濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素結(jié)果，選用葡萄糖、KH2PO4、蛋白胨為考察因素，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析（RSA）實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因子和水平見表1。其中x1、x2、x3分別代表葡萄糖、KH2PO4、蛋白胨的真實(shí)值，X1、X2、X3分別代表葡萄糖、KH2PO4、蛋白胨的編碼值，編碼和真實(shí)值關(guān)系式如下：

X1=（x1-30）/10；X2=（x2-2）/1；X3=（x3-3）/1

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Variables and experimental design levels for response surface methodology

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 碳源的篩選 碳源作為真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，能夠?yàn)檎婢纳L(zhǎng)代謝提供能量。真菌可以利用多種碳源，但對(duì)碳源的利用程度不同。如圖1所示，雙孢菇可以利用不同的碳源，但碳源類型對(duì)雙孢菇胞外多糖的產(chǎn)量影響較大。其中以葡萄糖為碳源時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量要高于其他幾種碳源。因此，選用葡萄糖作為雙孢菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖1 碳源對(duì)雙孢菇孢外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source type on exopolysaccharides production

2.1.2 氮源的篩選 氮源是真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，用于合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮類代謝物。如圖2所示，雙孢菇能很好的利用有機(jī)氮源（豆餅粉、酵母粉、蛋白胨），而對(duì)無機(jī)氮源（尿素、硫酸銨）的利用率不高。原因可能在于有機(jī)氮提供的是蛋白質(zhì)和氨基酸，真菌中的蛋白酶會(huì)將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，這樣菌體就可以直接吸收氨基酸，利于菌體的生長(zhǎng)[14]。在三種有機(jī)氮源中，蛋白胨的效果要好于另外兩種有機(jī)氮源（豆餅粉、酵母粉）。因此，選用蛋白胨作為液體培養(yǎng)基的氮源。

圖2 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type on exopolysaccharides production

2.1.3 無機(jī)鹽的篩選 除了碳源和氮源，微生物還需要一定的無機(jī)鹽調(diào)節(jié)生長(zhǎng)代謝，例如磷是核酸和蛋白質(zhì)的重要成分，能夠影響微生物的生長(zhǎng)；作為許多重要酶的激活劑，鎂能夠影響基質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)合成；鉀離子能促進(jìn)糖代謝。不同無機(jī)鹽對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖3所示。由圖3可以看出，添加KH2PO4的發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量較大，說明KH2PO4對(duì)雙孢菇胞外多糖的合成代謝調(diào)節(jié)作用優(yōu)于其他幾種無機(jī)鹽。因此，選擇在液體培養(yǎng)基中添加KH2PO4。

圖3 無機(jī)鹽對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of mineral salt on exopolysaccharides production

2.2 培養(yǎng)基各成分添加量的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 葡萄糖濃度對(duì)胞外多糖的影響 根據(jù)碳源篩選結(jié)果，雙孢菇液體發(fā)酵選用葡萄糖作為碳源。如圖4所示，考察了葡萄糖濃度對(duì)雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量的影響。由圖4可以看出，隨著葡萄糖濃度的增加，胞外多糖產(chǎn)量增加；當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到30g/L時(shí)，雙孢菇發(fā)酵液中胞外多糖的含量為1.25g/L；但當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)增加時(shí)，雙孢菇胞外多糖的產(chǎn)量反而下降，這表明過高的葡萄糖濃度不利于胞外多糖的轉(zhuǎn)化。因此，在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)葡萄糖的最佳濃度為30g/L。

圖4 葡萄糖濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of glucose on exopolysaccharides production

2.2.2 蛋白胨濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響 如圖5所示，在1～3g/L范圍內(nèi)，胞外多糖的產(chǎn)量隨著蛋白胨濃度的增加而增加，但當(dāng)?shù)鞍纂藵舛瘸^3g/L時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量隨著蛋白胨濃度的增加而降低。這表明過高的蛋白胨濃度不利于胞外多糖的轉(zhuǎn)化，只有適宜的濃度才有利于胞外多糖的轉(zhuǎn)化。原因可能在于蛋白胨的增加使發(fā)酵液過于稠密，黏度增大，影響發(fā)酵液中的溶氧。由圖5可知，在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)蛋白胨的最佳濃度為3g/L。

圖5 蛋白胨濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of peptone on exopolysaccharides production

2.2.3 KH2PO4濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響 如圖6所示，在1～2g/L范圍內(nèi)，胞外多糖的產(chǎn)量隨著KH2PO4濃度的增加而增加，但當(dāng)KH2PO4濃度超過2g/L時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量隨著KH2PO4濃度的增加而降低。這表明過高的KH2PO4濃度不利于胞外多糖的轉(zhuǎn)化，只有適宜的濃度才有利于胞外多糖的轉(zhuǎn)化。原因可能在于KH2PO4作為酶激活劑能夠激活雙孢菇胞外多糖合成酶的活性，但若KH2PO4濃度過高則可能會(huì)抑制合成酶活性，阻礙胞外多糖的生產(chǎn)、分泌。由圖6可知，在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)KH2PO4的最佳濃度為2g/L。

圖6 KH2PO4濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of KH2PO4on exopolysaccharides production

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 表2中顯示不同發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)蘑菇胞外多糖量產(chǎn)量的影響。第13～15次實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用于考察模型的誤差。第9組設(shè)計(jì)中胞外多糖實(shí)測(cè)量最低（0.76g/L），第14組設(shè)計(jì)中測(cè)得胞外多糖量為最大值（1.81g/L）。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental results

對(duì)表2中雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表3所示，可以看出建立的回歸模型顯著（p＜0.05）；擬合度好，預(yù)測(cè)值（y）與實(shí)測(cè)值（x）之間具有高度相關(guān)性（y=0.9916x+0.0116，R2=0.9916），僅有約4%的胞外多糖總變異不能用該模型解釋（R2Adj=0.9765）。

表3 蘑菇胞外多糖多項(xiàng)式回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model for optimization of exopolysaccharides

根據(jù)表3的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)以及X1X3的交互項(xiàng)對(duì)胞外多糖的合成有極顯著（p＜0.01）影響。根據(jù)對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析及表3，胞外多糖預(yù)測(cè)值（Y）對(duì)應(yīng)自變量葡萄糖（X1）、KH2PO4（X2）、蛋白胨（X3）的二元回歸方程為：

Y（g/L）=1.79+0.23X1+0.089X2+0.13X3-0.10X1X3-0.22X12-0.27X22-0.27X32。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析 根據(jù)回歸方程繪制的響應(yīng)面及等高線，如圖7～圖9所示。

圖7 葡萄糖與KH2PO4交互影響雙孢菇胞外多糖的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the combined effects of glucose and KH2PO4on the exopolysaccharides

圖8 葡萄糖與蛋白胨交互影響蘑菇胞外多糖的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot and contour plot of the combined effects of glucose and peptone on the exopolysaccharides

圖9 蛋白胨與KH2PO4交互影響蘑菇胞外多糖的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot and contour plot of the combined effectsofpeptoneand KH2PO4ontheexopolysaccharides

KH2PO4和葡萄糖對(duì)雙孢菇胞外多糖的影響如圖7所示。由圖7可見，當(dāng)KH2PO4濃度一定時(shí)，雙孢菇胞外多糖隨著隨葡萄糖含量的增加而增加，但葡萄糖大于0.5（35g/L）時(shí)，胞外多糖含量呈下降趨勢(shì)；當(dāng)葡萄糖濃度一定時(shí)，隨著KH2PO4濃度的增加，雙孢菇胞外多糖產(chǎn)量先增加后下降；當(dāng)KH2PO4濃度大于2.0g/L時(shí)，雙孢菇胞外多糖隨KH2PO4濃度的增加而下降。原因可能在于磷元素不僅是核酸與蛋白質(zhì)的必要成分，而且是參與能量代謝的重要物質(zhì)，磷酸根離子能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)電子傳遞和還原性輔酶的積累與氧化，影響著許多代謝產(chǎn)物的合成[15-16]。適宜的磷酸根濃度有利于雙孢菇胞外多糖的合成與分泌。但過高的KH2PO4濃度會(huì)引起胞外多糖產(chǎn)量的下降，這表明過高的KH2PO4濃度抑制了胞外多糖的產(chǎn)生。

圖8顯示了葡萄糖與蛋白胨對(duì)雙孢菇胞外多糖的影響。由等高線圖呈橢圓形及方差分析，可以直觀地看出葡萄糖與蛋白胨的交互作用顯著。作為雙孢菇生長(zhǎng)所必需生長(zhǎng)因素[17]，葡萄糖不僅顯著影響雙孢菇菌體的生長(zhǎng)，而且能夠促進(jìn)胞外多糖的合成與分泌。當(dāng)葡萄糖含量一定時(shí)，隨蛋白胨濃度的增加，胞外多糖含量先增加后下降，若蛋白胨濃度過高，則會(huì)對(duì)雙孢菇胞外多糖的分泌產(chǎn)生不利影響；當(dāng)?shù)鞍纂藵舛纫欢〞r(shí)，胞外多糖產(chǎn)量隨著葡萄糖濃度的增加而增加；但過高的蛋白胨濃度反而會(huì)引起胞外多糖產(chǎn)量的下降，這說明雙孢菇胞外多糖的合成與分泌需要適宜碳氮比。

圖9為葡萄糖與蛋白胨對(duì)雙孢菇胞外多糖的響應(yīng)面及等高線圖。如圖9所示，當(dāng)KH2PO4濃度一定時(shí)，隨蛋白胨濃度的增加，雙孢菇胞外多糖的含量先增加后下降；當(dāng)?shù)鞍纂藵舛纫欢〞r(shí)，隨KH2PO4濃度的增加，胞外多糖的含量先增加后下降；這與圖5、圖6顯示出的規(guī)律一致。

2.3.3 模型的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證雙孢菇胞外多糖模型的精確性，對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化后的雙孢菇液體發(fā)酵胞外多糖培養(yǎng)基組成為：葡萄糖35.66g/L，KH2PO42.07g/L，蛋白胨3.12g/L；考慮實(shí)際應(yīng)用性，將培養(yǎng)基參數(shù)修正為：葡萄糖35.7g/L，KH2PO42.1g/L，蛋白胨3.1g/L，按照此最佳培養(yǎng)基參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，胞外多糖含量平均值為1.87g/L，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值（1.86g/L）相差0.53%。表明此模型是可行有效的，并具有一定的實(shí)踐參考價(jià)值。

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)基的篩選，確定了雙孢菇液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基：碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，無機(jī)鹽為KH2PO4。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)雙孢菇胞外多糖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，通過響應(yīng)面法對(duì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，得到影響胞外多糖的二次多項(xiàng)式回歸模型，并對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。最終得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：葡萄糖35.7g/L，KH2PO42.1g/L，蛋白胨3.1g/L；在此條件下可得到胞外多糖的最大產(chǎn)量，預(yù)測(cè)值為1.86g/L，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到胞外多糖的產(chǎn)量為1.87g/L，與理論預(yù)測(cè)值基本一致。

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