陳真珍 王凱華 黃龍堅(jiān)

廣西中醫(yī)藥大學(xué) 南寧 530001

缺血性腦卒中是危害人類健康的三大疾病之一，目前雖然早期動(dòng)脈溶栓治療能夠獲得滿意措施，但由于其嚴(yán)格的時(shí)間窗和禁忌證及出血風(fēng)險(xiǎn)，將絕大多數(shù)的患者擋在門外。所以尋找缺血再灌注損傷后有效的腦保護(hù)措施，以減少神經(jīng)元死亡，改善神經(jīng)功能成為研究的熱點(diǎn)。JAK （Janus kinase）／STAT （signal transducer and activator of transcription）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病中的多種炎癥病理過(guò)程［1］，而JAK2／STAT3在腦缺血再灌注后損傷中扮演何種角色，調(diào)節(jié)其表達(dá)是否能夠減輕腦損傷仍未明確。本研究通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察P-JAK2、P-STAT3表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能缺損的相關(guān)性，探討JAK2／STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用，為研究有效的治療措施提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和抗體 兔抗鼠P-JAK2（pTyr1007／1008）多克隆抗體、兔抗鼠P-STAT3（pTyr705）多克隆抗體購(gòu)于CST公司，Tunel凋亡試劑盒購(gòu)自Roche公司，AG490（P-JAK2抑制劑）以及蛋白酶K 購(gòu)自Sigma公司，SABC 免疫組化染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，DAB 顯色試劑盒購(gòu)自碧云天公司，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 腦缺血再灌注模型建立 72 只健康成年雄性SD 大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量（300±20）g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)將分為假手術(shù)組、模型組與AG490組。模型組與AG490組參照改良Longa法［2］建 立 大 腦 中 動(dòng) 脈 閉 塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈但不插線。蘇醒后根據(jù)Longa’s的5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分：正常，未見(jiàn)任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1分：垂直提起時(shí)前爪不能伸直；2分：行走時(shí)身體向右傾，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)身體向右側(cè)跌倒；4分：不能自發(fā)行走或有意識(shí)障礙。選取1～3分的動(dòng)物則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 取材與處理 分別取6h、24h、3d、7d時(shí)間點(diǎn)大鼠，10%水合氯醛（3.5mL／100g）腹腔注射麻醉后，心臟灌注生理鹽水以及4%多聚甲醛，灌注完畢迅速斷頭取腦，將腦組織放于4%甲醛溶液中固定保存，以作石蠟切片，用于免疫組化檢測(cè)和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)P-JAK2、P-STAT3的表達(dá) 采用SABC 法，步驟簡(jiǎn)述如下：（1）常規(guī)切片脫蠟至水，3%H2O2室溫封閉；（2）將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，循環(huán)2～3次，間隔5～10min；（3）山羊血清封閉液；（4）分別滴加一抗，其中P-JAK2（1：500）、PSTAT3（1：350）于4℃冰箱過(guò)夜。此外，用PBS取代一抗作空白對(duì)照；（5）加二抗室溫孵育20min；（6）滴加試劑鏈霉素親和素-生物素符合物（SABC，1：100），室溫孵育2h。以上各步驟均需0.02M PBS漂洗；（7）DAB染色，蘇木素輕度復(fù)染，進(jìn)行脫水、透明、封片、觀察。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行操作。步驟如下：（1）二甲苯浸洗2 次后用梯度乙醇各浸洗1次；（2）Proteinase K 工 作 液 處 理 組 織20 min；（3）加50μL TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μL 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h；（4）加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞；（5）玻片干后加50μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30 min；（6）DAB 染色，蘇木素復(fù)染，進(jìn)行脫水、透明、封片、光鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用±s描述，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損情況 各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況見(jiàn)表1所示，各時(shí)間點(diǎn)AG490組均輕于模型組。

表1 3組大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況 （n＝6）

2.2 免疫組織化學(xué)染色 假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)均可偶見(jiàn)P-JAK2、P-STAT3陽(yáng)性表達(dá)，模型組自再灌注6h后即可觀察到明顯的P-JAK2陽(yáng)性細(xì)胞，24h開(kāi)始明顯增高，3d達(dá)到高峰，以后逐漸下降，至7d 仍有表達(dá)。而抑制劑組6h時(shí)可觀察到較少量的P-JAK2陽(yáng)性細(xì)胞，3d出現(xiàn)高峰隨后開(kāi)始下降，7d 時(shí)只見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞。而PSTAT3則于24h達(dá)到高峰后開(kāi)始下降（見(jiàn)表2、表3，圖1）。

表2 3組大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)（紋狀體）P-JAK2表達(dá)情況 （n＝6）

表3 3組大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)梗死區(qū)（紋狀體）P-STAT3表達(dá)情況 （n＝6）

圖1 72h時(shí)間點(diǎn)P-JAK2表達(dá)情況以及24h 時(shí)間點(diǎn)P-STAT3

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，模型組與抑制劑組隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞逐漸增加，并于24h 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰，隨之逐漸下降，抑制劑組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡數(shù)量均較模型組少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

表4 3組大鼠各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況

3 討論

Sehindle C于1992年在一項(xiàng)有關(guān)干擾素的研究中發(fā)現(xiàn)了JAK／STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。JAK 屬于非受體型的酪氨酸蛋白激酶，目前已發(fā)現(xiàn)JAK1～3 和TYK2 四個(gè)成員，而STAT 屬于胞漿蛋白家族，由STAT1～4、STAT5a、STAT5b和STAT6組成。JAK／STAT 信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多個(gè)生理病理過(guò)程，是重要的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑［3］。已有的研究提示JAK 和STAT 參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及病理過(guò)程［4］。在腦缺血再灌注損傷的形成中，白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子等炎性細(xì)胞因子大量的釋放發(fā)揮了重要作用［5］。而這些細(xì)胞因子則必需通過(guò)各種受體超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)才能發(fā)揮效應(yīng)，JAK／STAT 信號(hào)傳導(dǎo)通路則是其中一條重要路徑。JAK2、STAT3作為該通路的家族成員之一，以往對(duì)其在腦缺血再灌注損傷中作用的研究結(jié)果并不一致［6］，可能與不同研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法學(xué)方面的差異有關(guān)。本研究結(jié)果顯示JAK2、STAT3 在腦缺血再灌注后發(fā)生激活，表現(xiàn)為PJAK2、P-STAT3的高表達(dá)，并和神經(jīng)功能缺損、神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在密切相關(guān)性。而使用JAK2特異性抑制劑AG490后，P-JAK2、P-STAT3的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，同時(shí)神經(jīng)功能缺損情況減輕，提示JAK2、STAT3的激活在腦缺血再灌注損傷中起到了破壞作用。

JAK／STAT 信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活不僅通過(guò)損傷神經(jīng)元及各種炎癥病理過(guò)程參與腦缺血再灌注的后續(xù)損傷，同時(shí)對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響，使其成為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，嚴(yán)重影響了腦卒中后的神經(jīng)功能恢復(fù)［7］。本研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注后6h即可觀察到P-JAK 和P-STAT免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞，并分別于24h和72h到表達(dá)高峰，并持續(xù)到7d時(shí)仍有表達(dá)，使用JAK2特異性抑制劑的大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)功能缺損均輕于模型組。但P-JAK 和P-STAT 在不同大腦區(qū)域，不同細(xì)胞以及不同時(shí)間等的表達(dá)情況尚缺乏系統(tǒng)研究。雖然P-JAK 和P-STAT 腦缺血再灌注損傷中的機(jī)制還未完全明確，但其在腦缺再灌注損傷后表達(dá)的變化為治療提供了新的靶點(diǎn)。通過(guò)應(yīng)用特異性抑制劑、激動(dòng)劑以及結(jié)合臨床有效的干預(yù)措施進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究將有助于進(jìn)一步闡明P-JAK2和P-STAT3的作用，為研發(fā)新的缺血性腦卒中治療措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Bright JJ，Kanakasabai S，Chearwae W，et al.PPAR Regula-tion of Inflammatory Signaling in CNS Diseases［J］.PPAR Res，2008，2008：658-660.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［3］Jason S，Rawlings，Kristin M.The JAK／STAT signaling pathway［J］.Cell Science，2004，117：1 281-1 283.

［4］Stephanou A，Scarabelli TM，Brar BK，et a1.Induction of Apoptosis and Fas Receptor／Fas Ligand Expression by Ischemia／Reperfusion in Cardiac Myocytes Requires Serine 727of the STAT-1 Transcription Factor but Not Tyrosine［J］.J Bid Chem，2007，276：28 340-28 341.

［5］Stroll G，Jander S，Schroeter M.Detrimental and beneficial effects of injury induced infl-ammation and cytokine expression in t h e nervous system［J］.Adv ExpMed Bio，2002，513：87-113.

［6］Satriotomo I，Bowen KK，Vemuganti R.JAK2and STAT3 activation contributes to neuronal damage following transient focal cerebral ischemia［J］.J Neurochem，2006，98（5）：1 353-1 368.

［7］Leung M，Pankhyurst SA，Dunlop，et al.Metallohione in induces a regenerative reactive astrocyte phenotype via JAKSTAT at RHOA signaling pathways［J］.Experimental Neurology，2010，221：98-106.