吳學(xué)玲，張?jiān)旗o，劉代剛，段 紅，范宏偉，劉學(xué)端

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院 教育部生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410083)

At.ferrooxidans是一種以亞鐵、硫粉或者金屬硫化物作為能源物質(zhì)的革蘭氏陰性、化能自養(yǎng)和嗜酸的中溫浸礦菌[1]，工業(yè)上廣泛應(yīng)用于銅、鋅、鎳、鎘和其他金屬離子的生物浸出[2]。在生物浸出過(guò)程中，At.ferrooxidans經(jīng)常遇到許多不利的環(huán)境變化，如生長(zhǎng)環(huán)境溫度升高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、pH值改變和有毒重金屬的出現(xiàn)[3]。然而At.ferrooxidans對(duì)某些金屬離子具有較強(qiáng)的抗性，研究發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中加入 600 mmol/L的 Zn2+或者 200 mmol/L的 Cu2+之后，At.ferrooxidans仍然能夠生長(zhǎng)[4]，這使At.ferrooxidans在回收銅或者鋅等金屬的生物浸出過(guò)程中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值[5]。因此，研究這些微生物耐受高濃度金屬離子的分子機(jī)制意義重大。At.ferrooxidans DC菌株從中國(guó)廣西大廠礦區(qū)的酸性礦坑水中分離出來(lái)，利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜測(cè)定來(lái)自大廠礦區(qū)的礦坑水樣品的元素組成，結(jié)果表明樣品中含有多種元素，例如錳、鋅、鎘、銅、鐵和硫等，其中錳、鋅和鎘含量分別是 815.9、1655.71 和 56.13 mg/L[6?7]。

雖然鋅和錳對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)是必需的微量元素，許多重要的功能蛋白和酶都需要鋅作為其結(jié)構(gòu)或者輔助因子[8?9]。但是，一旦體內(nèi)鋅離子的濃度過(guò)高，將會(huì)對(duì)呼吸鏈產(chǎn)生抑制從而對(duì)細(xì)胞造成毒害作用[10?11]。錳以幾種不同的價(jià)態(tài)存在，作為蛋白輔因子時(shí)它在電子傳遞反應(yīng)中起催化劑的作用。同時(shí)，錳是必需的金屬酶的組分，包括依賴于Mn2+的超氧物歧化酶。另外，錳是許多酶的激活劑，這些酶主要參與不同的代謝途徑如 DNA合成、糖代謝或者蛋白修飾等。與其他必需的過(guò)渡態(tài)金屬一樣，過(guò)量的錳對(duì)生物體也會(huì)產(chǎn)生毒害作用。因?yàn)殄i和鐵競(jìng)爭(zhēng)共同的轉(zhuǎn)運(yùn)體和配體，錳毒性的經(jīng)典效應(yīng)是引起缺鐵[12]。鎘對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)是一種非必需的重金屬元素，少量存在就對(duì)生物體造成很大的毒害作用。大廠礦區(qū)的浸礦液中金屬離子的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出At.ferrooxidans生長(zhǎng)需要的微量元素，但是At.Ferrooxidans依然能很好地生長(zhǎng)，說(shuō)明它能夠耐受很高濃度的金屬離子。然而，至于是何種機(jī)制使 At.ferrooxidans具有如此高的抗錳、鋅和鎘的能力至今仍不清楚。關(guān)于At.ferrooxidans對(duì)金屬的抗性研究集中在Cu2+、As3+及Ag+的抗性機(jī)制，而關(guān)于其對(duì)Mn2+、Zn2+和 Cd2+的抗性機(jī)制較少被報(bào)道。本文作者旨在通過(guò)研究金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因在金屬離子脅迫下的相對(duì)表達(dá)，說(shuō)明金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因編碼的蛋白參與金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)方面研究At.ferrooxidans耐受高濃度金屬離子的分子機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)的保護(hù)細(xì)胞免受高濃度Zn2+的毒害的外排系統(tǒng)有3類：耐藥結(jié)節(jié)分化家族RND (Resistance, nodulation and division)，多藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體、P型ATP酶和陽(yáng)離子擴(kuò)散推動(dòng)子[13]。幾個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族參與 Mn2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，包括陽(yáng)離子/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，與抗性相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體，陽(yáng)離子促進(jìn)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)體家族和P型ATP酶[14]。CadA P型ATP酶和RND CzcCBA 復(fù)合物參與Cd2+的外排[15]。

本文作者以 4個(gè)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)作為目標(biāo)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)[16?17]驗(yàn)證它們?cè)诓煌瑵舛萙n2+、Mn2+和Cd2+的脅迫下的相對(duì)表達(dá)，并采用生物信息學(xué)手段對(duì)這4個(gè)基因及其編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)，為研究At.ferrooxidans對(duì)金屬離子的抗性機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

At.ferrooxidans DC菌株由中南大學(xué)生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從取自廣西大廠銅礦的酸性礦坑廢水中分離得到。

At.ferrooxidans DC菌株生長(zhǎng)于 9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基[18]，30 ℃，170 r/min 搖床無(wú)菌培養(yǎng)。能源物質(zhì)為單質(zhì)硫 10 g/L。

1.1.2 其他試劑

DNA提取試劑盒為TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN Inc.)，DNA凝膠回收試劑盒為TIAgel midi purification Kit (TIANGEN)，PGM-T平末端連接試劑盒(TIANGEN Inc.)，RNA 提 取試 劑 為 Trizol(Invitrogen)，RNA純化試劑盒為 Rneasy mini kit(Qiagen)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Rever Tra Ace?qPCR RT Kit (TOYOBO)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取及4個(gè)基因的克隆測(cè)序

細(xì)菌基因組提取使用 TIANamp Bacteria DNA Kit，以提取后的基因組為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，40 s；退火60 ℃，45 s；延伸72 ℃，90 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠純化目的片段，將純化后的PCR產(chǎn)物平末端加A之后連接到PGM-T載體轉(zhuǎn)化到Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，重組菌在LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)之后挑取陽(yáng)性克隆子做穿刺管培養(yǎng)12 h后送去上海生物工程公司測(cè)序。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物均在表1中。

1.2.2 At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Mn2+、Zn2+及Cd2+最大耐受濃度的測(cè)定

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究中選用 0.32、0.34、0.36和0.38 mol/L的Mn2+，0.06、0.1、0.14和0.18 mol/L的Zn2+及0.04、0.06和0.08 mol/L的Cd2+作為脅迫環(huán)境。將At.ferrooxidans DC菌株接種至加入不同濃度的Mn2+、Zn2+和Cd2+的9K培養(yǎng)基中，起始菌濃度均為5×106cell/mL，30 ℃，170 r/min 搖床無(wú)菌培養(yǎng)。其中空白(Blank)是不接種不加入金屬離子的生長(zhǎng)條件，0 mol/L是接種但不加入金屬離子的生長(zhǎng)條件。每24 h測(cè)定培養(yǎng)液的pH值，測(cè)定10 d。

1.2.3 At.ferrooxidans DC菌株的生長(zhǎng)條件

根據(jù)最大耐受濃度的測(cè)定，本研究中選用 0.1、0.2、0.3和0.4 mol/L 的 Mn2+，0.04、0.08、0.12和0.16 mol/L的Zn2+以及0.04和0.08 mol/L的Cd2+作為刺激環(huán)境。首先將At.ferrooxidans DC菌株接種至9 K培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)離心收集菌種(4 ℃，10 min，12 000 r/min)，然后將所收集的菌接種于含有0、0.1、0.2、0.3 和 0.4 mol/L Mn2+和 0、0.04、0.08、0.12和0.16 mol/L Zn2+及0.04、0.08 mol/L Cd2+的9 K 培養(yǎng)基中，使菌的起始濃度均為5×107cell/mL，短暫培養(yǎng)之后，離心收集菌種，馬上進(jìn)行RNA提取。

1.2.4 RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取總RNA，用RNeasy mini kit (Qiagen)純化總RNA，用NanoDrop微量分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies)檢測(cè)RNA的濃度和純度。取等量的 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄采用 Rever Tra Ace?qPCR RT Kit (TOYOBO)，以總RNA中mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄后用 NanoDrop微量分光光度計(jì)測(cè)定每一個(gè)cDNA的濃度，然后將cDNA樣品濃度均稀釋至200 mg/L，于?20 ℃保藏備用。

1.3 RT-qPCR

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

分別以目標(biāo)基因及內(nèi)參基因?yàn)闃悠? 以cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。然后將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋, 取103～109做標(biāo)準(zhǔn)品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線, 做7個(gè)點(diǎn)。普通PCR程序如下：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR的反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃，3 min；變性 95 ℃，30 s；退火 58 ℃，30 s；延伸 72 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)；退火55～95 ℃，10 s, 每循環(huán)一次溫度增加0.5 ℃共80個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，選用16S rRNA為內(nèi)參基因[19]，陰性對(duì)照不加任何模板。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的引物如表2所列，數(shù)據(jù)采用Expression Macro? Version 1.1 (http∶//www.gene-quantification.info/ )軟件進(jìn)行處理。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

用 BLAST (http∶//www.ncbi.nih.gov/blast/Blast.cgi)進(jìn)行相似性搜索。ORF Finder(http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找基因的開(kāi)放閱讀框。ExPASy Proteomics Server (http∶//expasy.org/cgi-bin/ pi_tool)進(jìn)行蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及相對(duì)分子量的計(jì)算。PSORTb v.3.0(http∶//www.psort.org/psortb)做蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位。TMHMM Server v.2.0 (http∶//www.cbs.dtu.dk// servive-s/TMHMM-2.0/)做蛋白質(zhì)的跨膜分析。NCBI conserved domains(http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp sb.cgi)[20]尋找蛋白的保守區(qū)域。

表1 常規(guī)PCR引物Table 1 Primers used in regular PCR

表2 用于RT-qPCR的目標(biāo)基因的引物Table 2 Primers used for RT-qPCR of targeted genes

2 結(jié)果與討論

2.1 4個(gè)基因的克隆測(cè)序

以At.ferrooxidans DC基因組為模板通過(guò)擴(kuò)增和克隆得到 afe_0671、afe_0674、afe_1143和 afe_1144基因片段，說(shuō)明At.ferrooxidans DC菌株中含有這4個(gè)基因。各基因的測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST序列比對(duì)，結(jié)果顯示與At.ferrooxidans ATCC 23270中對(duì)應(yīng)的基因的序列相同，說(shuō)明這4個(gè)基因編碼的蛋白的功能與At.ferrooxidans ATCC 23270菌株中對(duì)應(yīng)的基因編碼的蛋白的功能可能相同。

2.2 At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Mn2+、Zn2+及Cd2+最大耐受濃度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不加入金屬離子時(shí)，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值從2.0降為1.18。加入不同濃度的金屬離子之后培養(yǎng)液的pH值變化受到不同程度的抑制，且隨著金屬離子濃度的增加，pH值變化越小。本研究中At.ferrooxidans DC菌株是以硫粉作為能源物質(zhì)，培養(yǎng)液pH值變化越小，說(shuō)明DC菌株的生長(zhǎng)被抑制作用越強(qiáng)。圖1所示為不同金屬離子濃度下pH值的變化曲線。從圖1(a)可以看出，當(dāng)Mn2+的濃度為0.32 mol/L，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值從2.0降為1.41，說(shuō)明DC菌株的生長(zhǎng)明顯的被抑制；當(dāng)Mn2+的濃度為0.38 mol/L，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值降為1.85，培養(yǎng)液的pH值變化很小，DC菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Mn2+的最大耐受濃度是0.38 mol/L。由圖1(b)可看出，當(dāng)Zn2+的濃度為0.06 mol/L時(shí)，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值從2.0降為1.25，At.ferrooxidans DC菌株的生長(zhǎng)較小的被抑制；當(dāng)Zn2+的濃度為0.18 mol/L時(shí)，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值沒(méi)有變化，At.ferrooxidans DC菌株的生長(zhǎng)完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Zn2+的最大耐受濃度是0.18 mol/L。由圖1(c)可看出，當(dāng)Cd2+的濃度是0.04 mol/L時(shí)，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值降為1.28，DC菌株的生長(zhǎng)較小的被抑制；當(dāng)Cd2+的濃度是0.08 mol/L時(shí)，培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)液的pH值降為 1.93，DC菌株的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對(duì) Cd2+的最大耐受濃度是0.08 mol/L。

圖1 不同金屬離子濃度下pH值變化曲線Fig.1 pH change curves at different metal ions concentrations∶ (a)Mn2+; (b)Zn2+; (c)Cd2+

以硫粉作為能源物質(zhì)時(shí)，At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Mn2+、Zn2+及Cd2+的最大耐受濃度分別是0.38、0.18和0.08 mol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mn2+、Zn2+和Cd2+對(duì)DC菌株毒害作用由大到小順序依次為 Cd2+、Zn2+、Mn2+。3種離子對(duì)DC菌株毒害作用大小不同包含兩方面的原因，一方面是3種金屬離子本身的毒性大小不同；另一方面是DC菌株對(duì)這3種金屬離子的解毒機(jī)制不同。鋅和錳對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)是一種必需的微量元素，低濃度時(shí)有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，其濃度超過(guò)正常生理濃度時(shí)就會(huì)產(chǎn)生毒害作用，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。而鎘對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)是一種非必需的元素，只要存在就會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用[21]，所以 Cd2+對(duì) At.ferrooxidans DC菌株的毒害作用最大。生物體有5種基本的機(jī)制即有毒金屬離子外排、酶的轉(zhuǎn)變、胞內(nèi)胞外的隔離、通過(guò)透性屏障的外排和降低細(xì)胞內(nèi)靶部位的敏感性保護(hù)細(xì)胞免受金屬離子毒害[22]。At.ferrooxidans中存在許多金屬抗性基因和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，這些基因編碼的蛋白可能參與金屬離子的解毒過(guò)程。

2.3 不同濃度Mn2+、Zn2+和Cd2+刺激下金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因的相對(duì)表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR后，溶解曲線峰帶單一，沒(méi)有雜峰出現(xiàn)，說(shuō)明引物的特異性較好；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值均接近于1，說(shuō)明Ct值與其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值之間的關(guān)系性好; 內(nèi)參基因16S rRNA在不同環(huán)境中的表達(dá)量均較為衡定，無(wú)顯著性差異(P＜0.05)。經(jīng)內(nèi)參基因校正，在Mn2+刺激下各基因的相對(duì)表達(dá)量如圖2(a)所示，在低濃度Mn2+(0.1 mol/L)刺激下，其中的3個(gè)基因(afe_0671，afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào)1.99、3.42和2.12倍，afe_0674的表達(dá)量沒(méi)有上調(diào)；在高濃度Mn2+(0.4 mol/L)刺激下，4個(gè)基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和 afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào)437.66、743.86、301.14和676.54倍。在Zn2+刺激下各基因相對(duì)表達(dá)量如圖2(b)所示，在低濃度Zn2+(0.04 mol/L)刺激下，4個(gè)基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào)1.3、1.32、4.13和5.7倍；在高濃度 Zn2+(0.16 mol/L)刺激下，4個(gè)基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào)237.78、85.49、227.41和149.29倍。在Cd2+刺激下各基因的相對(duì)表達(dá)量如圖2(c)所示，在低濃度Cd2+(0.04 mol/L)刺激下，4 個(gè)基因(afe_0671、afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào)3、3.29、5.02和6.06倍；在高濃度Cd2+(0.08 mol/L)刺激下，4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量分別上調(diào) 6.08、12.32、18.55和 32.03倍。從圖2中可以看出，在不同濃度的Mn2+、Zn2+及Cd2+的刺激下，4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量的表達(dá)量均上調(diào)，且隨著Mn2+、Zn2+及Cd2+濃度的增加，各基因上調(diào)的倍數(shù)升高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明At.ferrooxidans DC菌株中這 4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143 和 afe_1144)對(duì)于 Mn2+、Zn2+及Cd2+的脅迫非常敏感，且隨著金屬離子濃度的增加，其表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)升高，說(shuō)明它們可能與Mn2+、Zn2+及Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。

圖2 不同金屬離子濃度刺激下金屬轉(zhuǎn)運(yùn)基因的差異表達(dá)Fig.2 Differential expression of metal transport genes under different metal ions concentrations∶ (a)Mn2+; (b)Zn2+; (c)Cd2+

MOORE和HELMANN[23]認(rèn)為在金屬離子有限的條件下金屬離子和螯合復(fù)合物通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)；相反的，當(dāng)金屬離子積累到超過(guò)生理需求時(shí)，金屬螯合或者外排系統(tǒng)就會(huì)被誘導(dǎo)。另外，NAVARRO等[19]認(rèn)為隨著金屬離子濃度的增加基因表達(dá)量升高，編碼外排系統(tǒng)的基因被誘導(dǎo)。在金屬離子刺激下，4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達(dá)量上調(diào)，且隨著金屬離子濃度的增加，上調(diào)倍數(shù)增加，推測(cè)這4個(gè)基因編碼的蛋白的作用可能是外排金屬離子或者參與金屬離子的外排。雖然afe_0671和afe_1144編碼的蛋白被報(bào)道特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+[24?25]，但是afe_0671、afe_1143和afe_1144的表達(dá)量也被報(bào)道在Cu2+的刺激下上調(diào)[2,19]，說(shuō)明afe_0671、afe_1143和afe_1144所編碼的蛋白也與Cu2+的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。結(jié)合以前的報(bào)道推測(cè)，afe_0671、afe_1143和afe_1144所編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+、Cu2+和Cd2+的外排；afe_0674編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+及Cd2+的外排，至于其是否參與Cu2+的外排還沒(méi)有報(bào)道過(guò)。這些基因編碼的蛋白是否參與其他的金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，還有待實(shí)驗(yàn)證明。

在At.ferrooxidans ATCC 23270的全基因組中，afe_0671編碼重金屬外排系統(tǒng)蛋白， afe_1143編碼重金屬外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，MFP(Membrane fusion protein)subunit，afe_0671和afe_1144基因編碼屬于CzcA家族的重金屬外排泵蛋白。細(xì)菌中 CzcA是復(fù)合物CzcCBA的組分，化學(xué)滲透復(fù)合物 CzcCBA 是由CzcC(小的外膜蛋白)，CzcB(連接CzcA與CzcC形成一個(gè)連續(xù)的從細(xì)胞質(zhì)到胞外通道的周質(zhì)耦合蛋白)和CzcA(一個(gè)大的內(nèi)膜蛋白)組成一個(gè)內(nèi)外膜通道。另外，作為離子/質(zhì)子交換載體外排 Cd2+、Zn2+和 Co2+的CzcCBA復(fù)合物是金屬抗性家族RND的一個(gè)成員[26]。屬于CzcA家族的外排鎘、鋅、鈷的重金屬外排泵負(fù)責(zé)金屬的解毒。克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，At.ferrooxidans DC中的這4個(gè)基因的序列與At.ferrooxidans ATCC 23270中對(duì)應(yīng)的基因的序列相同，說(shuō)明這4個(gè)基因編碼的蛋白的功能與At.ferrooxidans ATCC 23270菌株中對(duì)應(yīng)的基因編碼的蛋白的功能可能相同。在標(biāo)準(zhǔn)菌株中，這4個(gè)基因編碼的蛋白的功能被推測(cè)為參與金屬離子的外排，所以，在At.ferrooxidans DC中，這4個(gè)基因編碼的蛋白的功能也是參與金屬離子的外排，驗(yàn)證了本文作者的推測(cè)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本文作者的推測(cè)，采用生物信息學(xué)的手段對(duì)這4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)及其編碼的蛋白進(jìn)行分析?；騛fe_0671的開(kāi)放閱讀框架的長(zhǎng)度為3114 bp，編碼一個(gè)相對(duì)分子量為112324.22 Da、等電點(diǎn)為9.18的12次跨膜的膜蛋白，該蛋白的保守序列是COG3696，被稱為假定的銀外排泵，主要參與無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；afe_0674基因的開(kāi)放閱讀框架的長(zhǎng)度為 363bp，編碼一個(gè)相對(duì)分子量為12701.82 Da，等電點(diǎn)為9.73的蛋白，它的保守區(qū)域是 cl02363，被稱為 CusF(Copper binding periplasmic protein )。在大腸桿菌中CusF是參與銅和銀抗性的周質(zhì)蛋白，CusF形成一個(gè)由5條鏈組成的β桶狀的 OB(Oligonucleotide/oligosaccharide binding)折疊。Cu2+結(jié)合到CusF保守的H36、M47 and M49殘基上；afe_1143基因的開(kāi)放閱讀框架的長(zhǎng)度為1320 bp，編碼一個(gè)相對(duì)分子量為47 204.05 Da、等電點(diǎn)為9.64的膜蛋白，它的保守區(qū)域是 PRK09783，其功能還沒(méi)有完全確定，暫時(shí)被稱為 CusB(copper/silver efflux system membrane fusion protein)。CusB連接內(nèi)膜外排泵CusA和外膜通道CusC介導(dǎo)對(duì)銅和銀的抗性，晶體結(jié)構(gòu)顯示 CusB具有多個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)[27]；afe_1144基因的開(kāi)放閱讀框架的長(zhǎng)度為3111 bp，編碼一個(gè)相對(duì)分子量為112 374.33 Da、等電點(diǎn)為9.34的12次跨膜的膜蛋白，它的保守區(qū)域是 COG3696，也被稱為推測(cè)的銀外排泵，參與無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。

3 結(jié)論

1)在不同濃度 Zn2+、Mn2+和 Cd2+的刺激下，以硫粉作為能源物質(zhì)時(shí)，At.ferrooxidans DC菌株對(duì)Mn2+、Zn2+、Cd2+的最大耐受濃度分別是 0.38、0.18和0.08 mol/L，且隨著金屬離子濃度的增加，DC菌株的生長(zhǎng)受到的抑制作用越大。

2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Mn2+、Zn2+和Cd2+對(duì)DC菌株毒害作用由大到小的順序依次為Cd2+、Zn2+、Mn2+。

3)在不同濃度 Mn2+、Zn2+和 Cd2+的刺激下，At.ferrooxidans DC菌株的4個(gè)基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，且隨著金屬離子濃度的增加，上調(diào)倍數(shù)增加，說(shuō)明這 4個(gè)基因?qū)τ贛n2+、Zn2+和Cd2+的脅迫非常敏感，而且這 4個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與金屬離子的濃度成正相關(guān)。

4)隨著金屬離子濃度的增加，基因的表達(dá)量升高，編碼外排系統(tǒng)的基因被誘導(dǎo)，由此推測(cè)這4個(gè)基因編碼的蛋白可能參與金屬離子的外排。結(jié)合以前的報(bào)道認(rèn)為，afe_0671、afe_1143和afe_1144編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+、Cu2+及 Cd2+的外排，afe_0674編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+及Cd2+的外排，至于其是否參與Cu2+的外排還沒(méi)有報(bào)道過(guò)。

5)生物信息學(xué)分析表明，這4個(gè)基因編碼的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子或者參與金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。基因afe_0671和afe_1144編碼的蛋白是參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的多次跨膜蛋白，基因afe_1143編碼的蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，基因afe_0674編碼的蛋白是一種參與Cu2+及Ag2+轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。

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