魏美榮　李國菊　張達(dá)　顏世果　戚向敏

[摘要] 目的 研究不同濃度角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF）對口腔黏膜上皮細(xì)胞凋亡的作用，為探討KGF在口腔黏膜病發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。方法 將不同濃度的KGF（對照組0 ng·mL-1，實(shí)驗(yàn)1組5 ng·mL-1，實(shí)驗(yàn)2組25 ng·mL-1，實(shí)驗(yàn)3組50 ng·mL-1）分別加入體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞，培養(yǎng)12、24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察其對細(xì)胞形態(tài)的影響，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，熒光實(shí)時(shí)定量檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 1）實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞貼壁明顯，且48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞核仁明顯。2）培養(yǎng)48 h時(shí)，4組之間的細(xì)胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著KGF濃度的增加，細(xì)胞凋亡率和Bax mRNA表達(dá)逐漸降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸升高（P<0.05）。結(jié)論 KGF可通過上調(diào)Bcl-2 mRNA和下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)抑制上皮細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 角質(zhì)細(xì)胞生長因子； 細(xì)胞凋亡； 口腔黏膜上皮細(xì)胞

[中圖分類號] R 783.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.005

細(xì)胞凋亡與口腔疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。角質(zhì)細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）為堿性成纖維細(xì)胞生長因子家族的一員，由間質(zhì)細(xì)胞分泌，通過旁分泌的途徑作用于上皮細(xì)胞。在本課題組前期的研究中，發(fā)現(xiàn)KGF與口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[2]，KGF在口腔黏膜上皮的顆粒層及棘層上皮細(xì)胞的表達(dá)水平較高。本研究將不同濃度的KGF作用于培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細(xì)胞，檢測其對口腔黏膜上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的影響，探討其在口腔黏膜病的發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源

人口腔黏膜上皮細(xì)胞系由山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，來源于日本早稻田大學(xué)，取第3～10代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器和試劑

改良無血清培養(yǎng)基D-KSFM（GIBICO公司，美國），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（中國Best-Bio公司），SYBR Premix Ex TapTM[寶生物工程（大連）有限公司]，KGF（Prospec公司，美國），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀ABI7500（Bio-Rad公司，美國），流式細(xì)胞儀 EPICS XL（Beckman公司，美國）。

1.3 口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

從液氮中取出細(xì)胞凍存管后，迅速放入到37 ℃水浴中，輕振蕩使其快速解凍。在紫外燈照射30～

40 min并通風(fēng)10 min的超凈臺中，將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液移入離心管后加入5～10 mL含10%胎牛血清及1%雙抗的培養(yǎng)液。離心800 r·min-1 8 min。去除上清后加入培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，接種。在37 ℃、5%

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇第2天更換培養(yǎng)液，每3天換液1次，待細(xì)胞生長到覆蓋瓶底壁80%時(shí)傳代。

口腔黏膜上皮細(xì)胞體積較小，貼壁生長，呈扁平的卵圓形或多角形如鋪路石狀。熒光角蛋白免疫組化標(biāo)記陽性。

1.4 口腔黏膜上皮細(xì)胞分組

取對數(shù)期口腔黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%融合時(shí)，加入D-KSFM培養(yǎng)24 h，去除原培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入含不同濃度KGF（實(shí)驗(yàn)1組5 ng·mL-1，實(shí)驗(yàn)2組25 ng·mL-1，實(shí)驗(yàn)3組50 ng·mL-1）的D-KSFM，對照組加入等體積無菌PBS（0 ng·mL-1KGF）。

1.5 KGF對細(xì)胞形態(tài)的影響

各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000 r·min-1，5 min）。用400 μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染液后輕輕混勻，2～8 ℃避光下孵育5 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。右上象限（FITC+/PI+）代表晚期凋亡和壞死細(xì)胞，右下象限（FITC+/PI-）代表早期凋亡細(xì)胞，左下象限（FITC-/PI-）代表活細(xì)胞。

1.7 熒光實(shí)時(shí)定量檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h后，收集細(xì)胞并提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)RNA濃度及純度檢測后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光Real-Time PCR反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex TaqTM （2×）10 μL，PCR上游引物（10 μm）0.4 μL，PCR 下游引物（10 μm）0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，DNA模版2.0 μL，dH2O 6.8 μL。以GAPDH為內(nèi)參，用ABI 7500 Real-Time PCR System儀器，在8聯(lián)管中進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃末次延伸5 min。引物序列見表1。所有反應(yīng)在ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)樣本檢測均重復(fù)3次，取其平均值。存儲熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線，得出各樣本的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle number，Ct）。采用2-ΔΔCt 法計(jì)算LOX-1 mRNA 的相對表達(dá)量，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，-ΔΔCt=空白對照組ΔCt值-實(shí)驗(yàn)組ΔCt值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對檢測結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KGF對細(xì)胞形態(tài)的影響

各組口腔黏膜上皮細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察，可見實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞遮光性強(qiáng)，細(xì)胞貼壁明顯；與其他各組相比，培養(yǎng)48 h時(shí)的第3組細(xì)胞遮光性明顯增強(qiáng)，且細(xì)胞核仁明顯，各組細(xì)胞未見明顯的形態(tài)改變。

2.2 細(xì)胞凋亡

口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，實(shí)驗(yàn)1組、2組、3組及對照組的細(xì)胞凋亡率分別為4.63±0.31、2.60±0.26、1.60±0.36、6.60±0.65。統(tǒng)計(jì)分析顯示，4組之間的細(xì)胞凋亡率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著KGF濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸降低（P<0.05）。

2.3 Bcl-2 mRNA的表達(dá)

不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)見表2。培養(yǎng)12 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)1、2組較對照組Bcl-2 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)3組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05）；培養(yǎng)24 h時(shí)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組較對照組的Bcl-2 mRNA表達(dá)均顯著增加（P<0.05），但各實(shí)驗(yàn)組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；培養(yǎng)48 h時(shí)，4組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著KGF濃度的增加，Bcl-2 mRNA表達(dá)逐漸升高（P<0.05）。

2.4 Bax mRNA的表達(dá)

不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞Bax mRNA的表達(dá)見表3。

培養(yǎng)12 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)1、2組較對照組Bax mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)3組Bax mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）；培養(yǎng)24、48 h時(shí)，4組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著KGF濃度的增加，Bax mRNA表達(dá)逐漸降低（P<0.05）。

3 討論

KGF主要由間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，以旁分泌形式作用于上皮細(xì)胞，特異性地刺激上皮細(xì)胞增生，而對間質(zhì)細(xì)胞及其他細(xì)胞無此作用。近年來發(fā)現(xiàn)：KGF不僅可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和分化，并能抑制上皮細(xì)胞的凋亡過程[3-4]。在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，KGF通過調(diào)節(jié)Bcl-2來抑制細(xì)胞的凋亡[5]。一切抑制或促進(jìn)凋亡的基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，最終均歸結(jié)為Bax與Bcl-2比值的改變[6]。細(xì)胞凋亡是Bcl-2蛋白與Bax蛋白共同作用的結(jié)果，Bax蛋白具有一個(gè)跨膜位點(diǎn)，Bcl-2的編碼區(qū)含有與Bax蛋白高度同源的BH1和BH2結(jié)構(gòu)域，在該區(qū)Bax可與Bcl-2形成異源二聚體或自身形成同源二聚體，是參與細(xì)胞凋亡的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。死亡細(xì)胞激活Bax，使Bax由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到了線粒體膜上。當(dāng)Bax過表達(dá)時(shí)，Bax在BH1和BH2結(jié)構(gòu)域形成的同源二聚體增多，使Bcl-2受到了抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加；當(dāng)Bcl-2過度表達(dá)時(shí)，其與Bax結(jié)合，異源二聚體增多，Bax受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，因此Bcl-2與Bax的比例是細(xì)胞死亡的敏感性變阻器[7]。在人正?？谇火つぶ?，KGF mRNA主要表達(dá)于間質(zhì)的部分成纖維細(xì)胞，少量表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，且主要表達(dá)于胞漿中，呈顆粒狀，而在上皮細(xì)胞中無表達(dá)[8]。重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子作用于KGF受體，可以產(chǎn)生與內(nèi)源性KGF相同的生物學(xué)活性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的口腔黏膜白斑（oral leukoplakia，OLK）組織中，基底膜上Bcl-2蛋白呈弱陽性表達(dá)，經(jīng)維A酸治療后，Bcl-2蛋白無表達(dá)。在采用雙盲法治療OLK的研究中，Piattelli等[10]發(fā)現(xiàn)局部使用維A酸后，患者的病損面積減小，口腔病損明顯改善，且病損組織中基底層細(xì)胞中未檢測到Bcl-2蛋白的表達(dá)。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：Bax在OLK未惡變的組織中無高頻率表達(dá)。Bcl-2家族在OLK的發(fā)生發(fā)展及治療中發(fā)揮了重要作用。在大鼠輻射復(fù)合皮膚損傷模型[11]中，傷口周圍注射攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌SPK菌株后，炎癥反應(yīng)減輕，促進(jìn)了血管新生和肉芽組織形成，提高了皮膚傷口愈合速率。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KGF mRNA及蛋白在正?？谇火つそM、OLK組及口腔鱗癌組中的表達(dá)依次增加，且KGF在OLK上皮組織中的表達(dá)主要位于棘細(xì)胞層、顆粒層及不全角化層的上皮細(xì)胞中，而在基底細(xì)胞層的表達(dá)較弱；對OLK組織中Bcl-2蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)強(qiáng)于其在正常黏膜組織中的表達(dá)。綜合以上研究結(jié)果，筆者推測，在口腔黏膜組織疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，KGF是否通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)來調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的凋亡過程，從而在口腔黏膜病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用外源性KGF作用于體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞，觀察不同濃度的KGF對培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響，同時(shí)檢測KGF對培養(yǎng)的上皮細(xì)胞凋亡率的改變及對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞遮光性強(qiáng)，培養(yǎng)48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)3組的細(xì)胞核仁明顯；口腔黏膜上皮細(xì)胞的凋亡率隨KGF濃度增加逐漸降低；KGF對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)影響，在不同時(shí)間段、不同濃度時(shí)調(diào)控程度不同，12 h時(shí)實(shí)驗(yàn)3組Bcl-2 mRNA的表達(dá)開始上調(diào)；48 h時(shí)，KGF對Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)調(diào)控在各組均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Bcl-2 mRNA隨KGF濃度增加表達(dá)增強(qiáng)，Bax mRNA隨KGF濃度增加表達(dá)降低。Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增加，使Bax與Bcl-2比值發(fā)生改變，異源二聚體增多，Bax受到抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：KGF可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值發(fā)生改變，從而影響口腔黏膜上皮細(xì)胞的凋亡。

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（本文編輯 李彩）