王俊梅 平蘇寧 汪 泓 黃錦桃 陳大堤 李朝紅

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣州510080）

疏松結(jié)締組織平鋪片制作與觀察是我們組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生們動(dòng)手做的一個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，過去常常使用甲苯胺蘭染色，可以把結(jié)締組織中的肥大細(xì)胞清晰顯示，其它多數(shù)細(xì)胞核以及纖維的分布和數(shù)量亦可進(jìn)行大概的了解，但結(jié)締組織中的脂肪細(xì)胞卻只是呈現(xiàn)空泡狀，學(xué)生很難想象細(xì)胞內(nèi)脂滴的形態(tài)和分布。由于脂肪組織在基礎(chǔ)和臨床研究中占越來越重要的位置，讓學(xué)生們在短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)掌握結(jié)締組織與脂肪組織的染色，并觀察不同來源地的結(jié)締組織中脂肪組織的分布，對于后續(xù)課程的學(xué)習(xí)以及科研思維培養(yǎng)具有重要意義。本研究對這一實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行初步探討，建立穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件，使之具有制作快速、方法簡易、結(jié)果穩(wěn)定，可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，方便日后推廣。

材料和方法

1.材料

小鼠疏松結(jié)締組織，實(shí)驗(yàn)用解剖撥針，眼科剪刀，眼科鑷子，載玻片，蓋玻片等。

2.儀器

帶數(shù)字?jǐn)z影的光學(xué)顯微鏡。

3.試劑與配置

①油紅o染色液：油紅o 0.5g，50%乙醇100ml。將油紅o溶于乙醇內(nèi)，且不斷攪拌至完全溶解即可［1］。配制好的染液置磨口瓶內(nèi)保存?zhèn)溆?。?.3%甲苯胺藍(lán)液：甲苯胺藍(lán)0.3g，50%乙醇100 ml。③0.5%伊紅染色液：伊紅0.5g，50%乙醇100ml。

4.動(dòng)物的處理和取材

健康成年小鼠1只，體重30～50g，斷頭處死，將腸系膜剪下，放置于干凈的載玻片上，用解剖撥針將腸系膜輕輕薄層展開，借助于組織液黏附于載玻片上，使腸系膜展平繃緊?？諝飧稍?min。

5.染色步驟

①切片干燥后入50%乙醇稍洗；油紅o乙醇染液作用8min［2］；②50%乙醇分化，自來水終止分化；③室溫下加入甲苯胺藍(lán)液到載玻片的結(jié)締組織上，浸染10min；蒸餾水速洗；④室溫下加入伊紅染色液到載玻片的結(jié)締組織上，染色30s，蒸餾水沖洗［3］；⑤甘油封片。

結(jié) 果

鏡下可見通過甲苯胺藍(lán)－伊紅－油紅o染色的疏松結(jié)締組織平鋪片呈現(xiàn)藍(lán)色和紅色染色（圖1B），細(xì)胞和纖維均可清晰呈現(xiàn)，而單獨(dú)用甲苯胺藍(lán)染色主要呈現(xiàn)藍(lán)色（圖1A）。

細(xì)胞：兩種染色方法均可清楚顯示肥大細(xì)胞（圖1A，1B）。肥大細(xì)胞成群分布，胞質(zhì)紫紅色，細(xì)胞漿內(nèi)紫紅色顆粒粗大而均勻分布，胞核淡染。除此之外，甲苯胺蘭－伊紅－油紅o三色染色（圖1B）還可以清楚顯示紅染的脂肪細(xì)胞（圖1B左下角）。脂肪細(xì)胞成群分布，胞內(nèi)含深度紅染的脂滴。脂肪細(xì)胞大小不一，細(xì)胞內(nèi)含脂滴大小也不一。比如，有些脂肪組織中央細(xì)胞胞漿內(nèi)含有較大脂滴，而周邊有些脂肪細(xì)胞脂滴含量很少，有些甚至胞漿中沒有脂滴，該結(jié)果提示脂肪細(xì)胞具有不同的細(xì)胞表型。結(jié)締組織細(xì)胞胞核清晰。

圖1 甲苯胺蘭－伊紅－油紅o三色染色結(jié)締組織平鋪片A圖示肥大細(xì)胞，B圖右上角紫紅色染色的是肥大細(xì)胞，左下角為脂肪組織。放大倍數(shù)：物鏡／目鏡＝10×／10×。C圖為A圖局部放大，示肥大細(xì)胞，D圖紫紅色染色的是肥大細(xì)胞，紅染為脂滴。放大倍數(shù)：物鏡／目鏡＝10X／40XFig.1 Oil red－toluidine blue－eosin triple staining of loose connective tissueFig.A shows the mast cells and the dark blue stained cells on the top of right side in Fig.B are mast cells，while the fat tissue lies on the bottom of the left side.10×10.Fig.C enlarge the mast cells in Fig.A and the fat droplets are red stained in Fig.D.10×40

討 論

此研究有三個(gè)特點(diǎn)：一是在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加了新內(nèi)容；二是增加了學(xué)生親自動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)的分量；三是把科學(xué)研究的一些新的實(shí)驗(yàn)方法和新進(jìn)展引入到本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

疏松結(jié)締組織平鋪片及復(fù)合染色是組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法，學(xué)生可以自制標(biāo)本并染色，可在30分鐘內(nèi)完成此實(shí)驗(yàn)，并獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這是我們實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一直延續(xù)的做法。由于所用染料主要是甲苯胺蘭，鋪片中肥大細(xì)胞清晰可見。鋪片中的脂肪細(xì)胞卻呈空泡狀，脂肪細(xì)胞形態(tài)十分不明。油紅o為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色，脂肪滴呈紅色，細(xì)胞核藍(lán)色［1］。并且在配置油紅o時(shí)進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)，改用乙醇作為溶劑，可與甲苯胺蘭的溶劑相同，使得兩種染料趨于同性，可以很方便地獲得了理想結(jié)果。因此，學(xué)生們只是在原先親自動(dòng)手做實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上稍微增加了10分鐘的時(shí)間，就可獲得更多更美觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。更為重要的是，本方法的引入是由于參與教學(xué)的老師基于其課題研究所用的基本方法之一。李朝紅教授［4］長期以來從事心血管重構(gòu)分子機(jī)制與防治研究的課題，涉及到動(dòng)脈粥樣硬化等課題，其中有高血壓、高血糖、高脂血癥和肥胖等相關(guān)課題，油紅o染色是其學(xué)科組常用實(shí)驗(yàn)研究方法之一。將其引入到本實(shí)驗(yàn)中供學(xué)生親自動(dòng)做，可行性強(qiáng)，無實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。此外，脂肪組織的研究近年來已呈現(xiàn)活躍的趨勢，如脂肪干細(xì)胞、肥胖、高脂血癥脂質(zhì)代謝異常等均會(huì)涉及到此相關(guān)內(nèi)容［5］。學(xué)生們通過親自動(dòng)手染色并觀察結(jié)果，既可掌握了一種重要的科研實(shí)驗(yàn)方法為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)，更是通過對脂肪組織的染色和觀察，在引導(dǎo)學(xué)生們學(xué)習(xí)正常的組織結(jié)構(gòu)和功能的同時(shí)，增加學(xué)生們對臨床相關(guān)學(xué)科的科研興趣和現(xiàn)代最新知識的掌握，可謂是一舉多得。本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)工作是在課題組研究生的幫助下實(shí)施完成的，這樣既可提高研究生的帶教水平，同時(shí)使得我們師資隊(duì)伍得到了很好的補(bǔ)充，把教研室科研和教學(xué)工作連為一體，把年輕老師、研究生以及資深老教師科研工作緊密連接一體。使得人人熱心投入到教學(xué)改革工作中來，真正做到教學(xué)科研相輔相成，達(dá)到學(xué)生最終受益的目的。

組織學(xué)新增實(shí)驗(yàn)必須考慮的一個(gè)重要事項(xiàng)就是所增加的實(shí)驗(yàn)必須要求在短時(shí)內(nèi)能夠完成，保證在有限的實(shí)驗(yàn)課時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)并獲得結(jié)果。我們把新增的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容始終是放在從屬位置，一定是要在保證完成最基本的實(shí)驗(yàn)要求的條件下去實(shí)施。實(shí)驗(yàn)是三個(gè)學(xué)時(shí)，至少兩個(gè)學(xué)時(shí)用做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)切片的觀察，余下一個(gè)學(xué)時(shí)用于探索性實(shí)驗(yàn)。這樣既可保證最基本的課程知識的掌握，又能在有限的時(shí)間內(nèi)拓展相關(guān)知識和技能。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的好壞是決定能否最終成效顯著的關(guān)鍵，而這又完全有賴于老師對教學(xué)改革工作的熱愛、教學(xué)內(nèi)容的熟練和關(guān)注程度。

［1］唐海林，唐榮軍，宋穎等.一種改良的脂肪染色法.診斷病理學(xué)雜志，2006，13（2）：153－154

［2］周劍莉，胡檢生.脂肪染色法在臨床專業(yè)病理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2011，33（1）：55－56

［3］劉同慎，李冰，殷彥君.疏松結(jié)締組織鋪片染色新法.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，24（5）：519－520

［4］李朝紅.生物機(jī)械力對血管重構(gòu)的影響及機(jī)制.中國動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（1）：1－5

［5］Padilla J，Jenkins NT，Vieira－Potter VJ，et al.Divergent phenotype of rat thoracic and abdominal perivascular adipose tissues.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2013 Apr 1，304（7）：R543－552