王麗波 于澤源 徐雅琴 郝永峰 肖振平 張曉松

南瓜籽中一種抗真菌蛋白的提取及抗菌活性研究

王麗波 于澤源 徐雅琴 郝永峰 肖振平 張曉松

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

裸仁南瓜籽經(jīng)破碎，磷酸緩沖液4℃浸提，硫酸銨沉淀，上清液透析，SP-Sepharose FF陽(yáng)離子交換層析，Sephadex G-75凝膠層析柱，凍干等步驟純化得到一種新的抗真菌蛋白，命名為Pw-1，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步鑒定。SDS-PAGE分析顯示Pw-1蛋白的分子質(zhì)量約為14.8 ku。抗菌活性鑒定表明，該蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌3株真菌具有顯著的生長(zhǎng)抑制活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴的特征，IC50值分別為16.64、20.91和21.22μmol／L。加入胰蛋白酶后Pw-1蛋白的抗菌活性消失，表現(xiàn)出蛋白類物質(zhì)所具有的對(duì)于蛋白酶的敏感性。

南瓜籽 抗真菌蛋白 純化

南瓜籽又名南瓜仁，白瓜籽，金瓜籽，為葫蘆科植物南瓜的成熟種子。南瓜籽中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、植物甾醇以及各種礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分［1-3］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為南瓜籽味甘性溫，歸脾胃大腸經(jīng)，有驅(qū)蟲、下乳、健脾利水之功效，是一味藥食兩用的中藥［4］。

現(xiàn)代研究表明南瓜籽中含有多種具有離體抑制真菌生長(zhǎng)增殖能力的活性蛋白，如Xia等［5］從南瓜籽中提取出分子質(zhì)量約為29 ku的活性蛋白，具有N-糖苷酶活性，并對(duì)人類黑色素瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。Ng等［6］從南瓜籽中提取出2種分子質(zhì)量均為12 ku的小分子蛋白，都有抑制蛋白質(zhì)合成的活性。Wang等［7］從黑南瓜籽中提取到富含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸的分子質(zhì)量為8 ku的抗真菌蛋白。這些活性蛋白未來(lái)可作為天然防腐劑用于食品保鮮和保藏，以及用于抗農(nóng)作物病蟲害和醫(yī)藥的研究和應(yīng)用等，具有廣泛的研究意義。

本研究以裸仁南瓜籽為材料提取其總蛋白，通過(guò)兩步層析分離，純化得到一種抗真菌蛋白，并對(duì)該蛋白的分子質(zhì)量和抗菌活性進(jìn)行研究，為深入開展制備植物種子來(lái)源的抗真菌蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

寶庫(kù)1號(hào)裸仁南瓜籽：訥河市寶庫(kù)良種繁育研究所；SP交聯(lián)瓊脂糖凝膠、G-75葡聚糖凝膠：浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白（14.4～116 ku）：加拿大Pharmacia公司；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、大豆灰斑病菌（Cercospora sojina Hara）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院。所用試劑均為分析純。

Z36型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hermle公司；Fdu-1100冷凍干燥機(jī)：日本Eyela公司；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；lhs-25sc恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南瓜籽抗真菌蛋白的純化

500 g南瓜籽經(jīng)過(guò)低溫干燥后粉碎，過(guò)0.2 mm孔徑篩網(wǎng)，加入2 L磷酸鹽緩沖液（10 mmol／L，pH 7.0，含0.15 mol NaCl）、4℃勻漿，浸提6 h（同一樣品反復(fù)浸提3次），離心（4℃，12 000 r／min，15 min），上清液加入硫酸銨至30%飽和度，置于4℃ 10 h，12 000 r／min冷凍離心，收集上清液。加入硫酸銨至80%飽和度，12 000 r／min離心，沉沉淀用少量浸提緩沖液溶解后透析（MW 3.5 ku），12 000 r／min離心 10 min，收集上清液，冷凍干燥，所得蛋白為南瓜籽粗蛋白。

將上述粗蛋白0.5 mL（30 mg／mL）用平衡緩沖液充分透析平衡后，上樣于SP-Sepharose FF陽(yáng)離子交換柱上（1.0 cm×30 cm），在10 mmol／L醋酸（pH 4.5）緩沖體系中，用0～1 mol／L NaCl梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，280 nm檢測(cè)。將各收集管組分透析冷凍干燥，以黃瓜枯萎病菌作為指示菌檢測(cè)抗菌活性。

將有活性的洗脫組分充分透析，冷凍干燥后0.5 mL（30 mg／mL）進(jìn)一步用 Sephadex G-75凝膠層析柱（1.5 cm×20 cm）分離，pH 6.5，5 mmol／L的 PB緩沖液洗脫，控制流速為0.5 mL／min。收集洗脫峰，以黃瓜枯萎病菌作為指示菌測(cè)定各洗脫組分的抗真菌活性。

1.2.2 SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量

SDS-PAGE參考 Laemmli等［8］方法，用 Tris-HCl緩沖液，分離膠濃度15%，濃縮膠濃度5%，含0.1%SDS，恒壓200 V，電泳3 h。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定

采用牛津杯法［9］測(cè)定各層析收集組分的真菌生長(zhǎng)抑制活性。受檢真菌為黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢菌。將供試菌株點(diǎn)植于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板中心，于28℃培養(yǎng)至菌落直徑達(dá)到1～2 cm，在距離菌落邊緣1 cm處放置滅菌的牛津杯，各取100μL樣品組（含目的蛋白）和對(duì)照組（0.02 mol／L、pH 6.6 PBs緩沖液 100μL），用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后加入牛津杯內(nèi)，4℃預(yù)擴(kuò)散24 h，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察有無(wú)抗菌作用。

1.2.4 抑真菌半抑制濃度（IC50）的測(cè)定

參照Liu等［10］方法，將抗真菌蛋白混入約45℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體，每份總體積為15 mL，濃度分別為 0、5、10、20μmol／L。迅速混勻后分別倒入平皿（9 cm）待冷卻后接入少量等量菌體，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)5 d后，測(cè)量加入空白對(duì)照的菌圈直徑（D c）和加入樣品的菌圈直徑（D n）。抑制率I＝（D c-D n）／D c，根據(jù)抑制率和樣品濃度繪制曲線，可求得半抑制濃度IC50，本試驗(yàn)檢測(cè)了抗真菌蛋白對(duì)黃瓜枯萎菌、大豆灰斑菌、鏈格孢菌3種菌的半抑制濃度，每個(gè)濃度平行3次，測(cè)量時(shí)取其菌圈的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用quantity one軟件定量分析了SDS-PAGE圖譜。

2 結(jié)果和分析

2.1 南瓜籽抗菌蛋白的分離純化

南瓜籽粗蛋白經(jīng)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換柱分離，得到 A、B、C、D、E、F共 6個(gè)蛋白洗脫峰（圖1），用黃瓜枯萎病菌為指示菌，用平板擴(kuò)散法測(cè)定各峰抗菌活性，結(jié)果顯示C和E峰具有抗真菌活性。且E峰活性較高，所以選擇E峰進(jìn)一步純化。

將E峰組分上樣于Sephadex G-75凝膠層析柱進(jìn)一步分離，得到兩個(gè)洗脫峰分別稱為I、II（圖2），抗菌活性檢測(cè)結(jié)果表明，峰I具有較高的抗真菌活性，峰II沒有抗菌活性。

經(jīng)磷酸緩沖液浸提，硫酸銨鹽析，透析和冷凍干燥，從500 g南瓜籽中提取到1.9 g粗蛋白，E峰組分經(jīng)透析凍干后總質(zhì)量為70.4 mg，I峰洗脫液透析凍干后得到21.7 mg的終蛋白。

圖1 南瓜籽抗真菌蛋白的SP-Sepharose FF陽(yáng)離子交換層析

圖2 陽(yáng)離子交換層析活性洗脫峰E的Sephadex G-75凝膠排阻層析

2.2 抗真菌蛋白分子質(zhì)量測(cè)定

SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，所提取的南瓜籽粗蛋白（泳道B）組分較多，經(jīng)過(guò)兩步層析之后，I峰蛋白（泳道A）呈單一條帶，說(shuō)明其已達(dá)到電泳純。具有抗真菌活性的I峰蛋白命名為Pw-1。

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率Rf為橫坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lg Mr為縱坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝-1.112 7x+2.017 9，R2＝0.990 6，根據(jù)Pw-1蛋白的相對(duì)遷移率0.818，得出其分子質(zhì)量為14.8 ku。

圖3 南瓜籽抗真菌蛋白Pw-1的SDS-PAGE分析

2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性檢測(cè)

Pw-1蛋白抗菌效果如圖4所示，其對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌均有抑制作用（圖4a、b、c）。由表1的抑菌圈的直徑大小可以說(shuō)明，Pw-1蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌和大豆灰斑病菌的效果更顯著一些，隨著抗真菌蛋白濃度增加抗菌活性更高，呈現(xiàn)清晰的劑量依賴效應(yīng)。而在相同條件下，對(duì)照組菌絲擴(kuò)散沒有受到影響，菌落邊緣呈現(xiàn)規(guī)則的圓形。并且由圖4d可知，加入胰蛋白酶后抗菌活性消失，Pw-1蛋白表現(xiàn)出蛋白類物質(zhì)所具有的對(duì)于蛋白酶的敏感性。

圖4 Pw-1蛋白的抗真菌效果

表1 Pw-1蛋白對(duì)3種菌的抗菌作用對(duì)比

2.4 半抑制濃度

不同濃度的Pw-1蛋白對(duì)三種菌的抑制效果如圖5，根據(jù)抑制率（y）和濃度（x）做曲線，分別求得黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌、鏈格孢菌的IC50回歸方程。分別為 y＝0.028 1x+0.034 7（R2＝0.991 8）、y＝0.023 4x+0.019（R2＝0.989 5）、y＝0.023 7x+0.012 1（R2＝0.992 5）。根據(jù)各自的回歸曲線測(cè)得Pw-1蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌的 IC50值為16.64 μmol／L，對(duì)大豆灰斑病菌的 IC50值為 20.91μmol／L，對(duì)鏈格孢菌的IC50值為21.22μmol／L。

圖5 Pw-1蛋白對(duì)3種菌的IC50

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從裸仁南瓜籽中提取出了一種抗真菌蛋白Pw-1，通過(guò) SDS-PAGE分析，分子質(zhì)量為14.8 ku，不同于已報(bào)道的分子質(zhì)量分別為8、12 ku的南瓜籽抗真菌蛋白，是一種新的抗真菌蛋白。Pw-1蛋白對(duì)3株常見的農(nóng)業(yè)致病真菌黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，當(dāng)?shù)鞍兹芤簼舛葹?0μg／L時(shí)，抗菌圈直徑分別為9.4、8.3和8.0 mm，IC50值分別為 16.64、20.91和 21.22 μmol／L。這些數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究Pw-1蛋白的氨基酸序列、其他生物活性以及抗菌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Characterization of a Novel Antifungal Protein from Pumpkin Seeds

Wang Libo Yu Zeyuan Xu Yaqin Hao Yongfeng Xiao Zhenping Zhang Xiaosong
（College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

A novel antifungal protein is measured to be isolated from pumpkin seeds and designated Pw-1.The purification procedure consists of extraction with phosphoric acid buffer at 4℃，ammonium sulfate precipitation，dialysis，SP-Sepharose FF column，Sephadex G-75 column，freeze drying and other processes.Partial characterization and antifungal activity are assayed in the paper.The molecular mass of the purified Pw-1 was determined as 14.8 ku by SDS-PAGE.The protein exhibited antifungal activity to the Fusarium oxysporum，Cercospora sojina Hara，and Alternaria alternata in a dose-dependent with IC50values of 16.64，20.91，and 21.22μmol／L respectively.The antifungal activity of Pw-1 protein disappeared after trypsin addition，showing the protease sensitivity of protein.

pumpkin seeds，antifungal protein，purification

Q516

A

1003-0174（2014）03-0063-04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（12531052），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動(dòng)基金（2011QN208）

2013-04-24

王麗波，女，1979年出生，講師，天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用

于澤源，男，1961年出生，教授，園藝作物的采后加工和處理