■聶金梅 李陽源 鐘開新

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東珠海519060）

本研究首次采用去除基因信號肽、定點突變、重疊PCR等方法克隆得到來源于枯草芽孢桿菌的中性甘露聚糖酶基因，采用基因工程手段構建篩選得到一株高效分泌表達甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌株；初步研究了該甘露聚糖酶酶學性質，為將枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶用作工業(yè)用酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌Top10、畢赤酵母感受態(tài)細胞X33、pPICZαA均為本實驗室保存。菌株(Bacillus subtilis編號GIM 1.259)購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB、LBZ、BMGY培養(yǎng)基參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.1.3 試劑

SacI購自Fermentas公司，其它限制酶、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 設計引物

根據(jù)甘露聚糖酶全基因序列，設計引物WBmanF/WBmanR;WBman mutF/WBman mutR，引物序列設計見表1。

表1 研究所用引物序列

1.2.2 測定甘露聚糖酶活性方法

吸取2.00 ml經(jīng)過適當稀釋的酶液，37℃平衡10 min，加入2.0 ml槐豆膠溶液（0.5%），37℃平衡10 min，加入到50 ml比色管中，再加入5 mlDNS試劑，電磁振蕩3 s，以終止酶解反應。沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25 ml，電磁振蕩3 s。以標準空白樣為對照，在540 nm處測定吸光度值。酶活性定義：在37℃、pH值5.5條件下，1 min從濃度為1 mg/ml的甘露聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3 提取枯草芽孢桿菌基因組

枯草芽孢桿菌干粉于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中復壯2 d，30℃，靜置培養(yǎng)，此為第一代G1；劃線于LB培養(yǎng)基，長出單菌落，此為第二代G2；將G2代單菌落制成懸液，制備甘油冷凍管G2；挑取單菌落轉接斜面菌種，此為工作用菌種G3；制成懸液G3，提取枯草芽孢桿菌基因組，置于-20℃保存。

1.2.4 克隆甘露聚糖酶基因

用枯草芽孢桿菌基因組為模板、引物WBmanF/WBmanR，通過PCR方法克隆甘露聚糖酶編碼序列（WBMAN），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收約1.1 kb的片段。

1.2.5 定點突變法和重疊PCR法

設計一對突變引物WBman mutF/WBman mutR，采用重疊PCR方法擴增其編碼區(qū)基因序列。重疊PCR分四步進行，分別為PCR1、PCR2、PCR3和PCR4，PCR3反應體系是以PCR1和PCR2作模板兼做引物進行擴增，共18個循環(huán)；其余PCR擴增體系見表2，PCR反應條件見表3。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR反應條件

將PCR1和PCR2產物用1%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分析，分別切膠回收大小約為0.5 kb和0.6 kb的基因片段并純化，置于-20℃保存，具體操作參照PCR純化試劑盒。以上述PCR1和PCR2產物片段為模板和引物，進行PCR擴增，PCR3共18個循環(huán)；以PCR3產物為模板，以WBmanF及WBmanR為引物，進行PCR4擴增，將PCR4產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并切膠回收大小約1.1 kb基因片段，置于-20℃保存。取5 μl純化后的DNA進行瓊脂糖電泳分析。

1.2.6 體外構建重組質粒V-pPIC-WBmanmut

取甘露聚糖酶突變基因 WBmanmut以及pPICZαA各20 μl，用Not1和EcoR1雙酶切（37 ℃、3 h），T4連接酶連接（4℃過夜），轉化大腸桿菌Top10，轉化步驟如下：冰上放置30 min，42℃孵育90 s，冰上放置20 min，加1 mlLB培養(yǎng)基后37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布LBZ平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落共20個，采用菌落PCR法鑒定陽性克隆子，菌落PCR反應條件：94℃、4 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、2 min，72 ℃、10 min，30個循環(huán)。取10 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。對陽性克隆進行酶切鑒定以及測序序列，DNA測序由深圳華大基因公司完成。

1.2.7 構建重組工程菌株

將重組質粒V-pPIC-WBmanmut用DpnI線性化，采用電擊法將線性化的V-pPIC-WBmanmut轉化至畢赤酵母X33，涂布于YPDZ平板，30℃下靜置培養(yǎng)2～3 d，直至長出單菌落。

1.2.8 篩選高效分泌表達的葡萄糖氧化酶畢赤酵母工程菌株

挑取單菌落接種于裝有5 mlBMGY的50 ml離心管中，于28～30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為2～6時，添加甲醇至終溶度為0.6%，每隔24 h補加甲醇并留樣，采用測定酶活性的方法初步篩選高產菌株，再以1%的量接種至裝有50 mlBMGY的500 ml三角瓶中，用雙層紗布封口，于28～30℃、200 r/min的搖床培養(yǎng)，復篩得到一株高效分泌表達的甘露聚糖酶突變基因工程菌株，將它命名為V-X33-pPIC-WBmanmut。離心收集搖瓶發(fā)酵上清液，進行枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的酶學性質研究。

2 結果

2.1 甘露聚糖酶基因的克隆

以枯草芽孢桿菌基因組為模板，PCR擴增得到甘露聚糖酶基因，切膠純化目的片段（約1 100 bp）（見圖1）。測序分析由深圳華大基因公司完成,結果表明甘露聚糖酶基因大小為1 104 bp，編碼362個氨基酸。該基因與GenBank中已登錄的同類基因（NC_014976.1）的氨基酸序列具有95%以上的同源性。

2.2 含甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達質粒wbman-pic的構建

PCR4產物加入Taq酶擴增5個循環(huán)，在甘露聚糖酶基因3'端連接polyA尾部結構，再與PMD20-T載體連接，連接產物轉化至Top10，LBZ平板篩選陽性轉化子，挑取單菌落進行菌液PCR驗證（見圖2），提取質粒,將稀釋1 000倍的質粒作為模板，重疊PCR法擴增含突變位點的甘露聚糖酶基因，切膠純化目的片段(見圖3)；提取質粒，用EcoRI和NotI將重組突變甘露聚糖酶質粒和pPICZαA進行酶切，用PCR純化試劑盒純化，T4連接酶連接（4℃過夜），轉化至Top10細胞，LBZ平板篩選陽性轉化子，菌液PCR驗證后（見圖4），提取質粒，用EcoRI和NotI酶切質粒應得到1.1kb目的基因條帶和3.6 kb載體pPICZαA的基因條帶，酶切產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖5所示。

圖1 枯草芽孢桿菌基因組擴增甘露聚糖酶產物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質粒甘露聚糖酶PMD20-T PCR鑒定

圖3 枯草芽孢桿菌突變甘露聚糖酶基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

圖4 突變型甘露聚糖酶重組質粒PCR鑒定

圖5 突變型甘露聚糖酶重組質粒酶切分析

2.3 甘露聚糖酶基因的分泌表達

用Dpn1酶切突變型甘露聚糖酶重組質粒，柱式純化，將線性化的重組質粒電轉入畢赤酵母X33感受態(tài)細胞中，YPDZ平板篩選陽性表達載體。從140個單菌落中篩選出一株酶活力最高的工程菌株，接種至搖瓶誘導表達48 h后，產酶活性為120 U/ml。

2.4 枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的酶學性質研究

2.4.1 溫度對重組β-甘露聚糖酶的影響

在 pH 值 6.0的條件下，分別在 30、40、50、60、70℃，用DNS法測定重組β-甘露聚糖酶的酶活力，結果表明，在40℃時測定的酶活力最高（見圖6）。

為了研究重組甘露聚糖酶在不同溫度下的穩(wěn)定性，分別將上清液在30、40、45、50、55、60、65、70 ℃ 靜置5 min，然后在40℃、pH值6.0的條件下用DNS法測定酶的殘存活力，以40℃所測得的酶活力為100%，結果顯示，當溫度達到70℃時，剩余酶活力仍保留48%（見圖7）。

2.4.2 pH值對重組β-甘露聚糖酶的影響

在40 ℃條件下,分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0時,用DNS法測定重組β-甘露聚糖酶的酶活力,結果顯示，當pH值為6.0時，酶的催化活力最高，以40℃、pH值6.0時酶的催化活力為100%，pH值5.0～8.0時相對催化活力均在最適催化活力的80%以上(見圖8)。

圖6 甘露聚糖酶的最適催化溫度

圖7 甘露聚糖酶的耐溫性能

圖8 甘露聚糖酶的最適催化pH值

為了研究重組β-甘露聚糖酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性，分別將酶液在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的緩沖液中，置于4℃靜置4 h，然后在40℃、pH值6.0條件下，用DNS法測定甘露聚糖酶的殘存活力，以pH值為6.0時測得的酶活力為100%，結果表明，pH值在6.0～8.0范圍內，剩余酶活力均保留50%以上，具有較好的耐堿性（見圖9）。

2.4.3 金屬離子對重組β-甘露聚糖酶的影響

在酶上清液中分別加入終濃度為10 mM的Na+、Fe3+、Cu2+、Li+、Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Co2+、EDTA，室溫靜置20 min后測定酶的殘余酶活力。以不添加任何離子的酶上清液作對照，所測定的酶活力為100%。其它各組所測定的酶活力結果見圖10，各種離子對重組β-甘露聚糖酶的影響各不相同，但均保持59%以上的酶活。

圖9 甘露聚糖酶的耐酸堿性能

圖10 金屬離子以及EDTA對甘露聚糖酶活性的影響

3 討論

3.1 不同來源的甘露聚糖酶酶學性質（見表4）

甘露聚糖酶普遍存在于動物、植物和微生物中，其中微生物是甘露聚糖酶的主要來源，包括細菌、真菌和放線菌等。其中細菌包括芽孢桿菌[1]、假單胞菌，真菌中的曲霉菌[2]、里氏木霉菌[3]以及放線菌中的鏈霉菌[4]、酵母[5]等。已發(fā)現(xiàn)100余種來源于微生物的甘露聚糖酶，在實際生產和基礎研究中已得到了廣泛應用，它具有活性高、成本低、提取方便等優(yōu)點。來源于不同微生物的甘露聚糖酶性質存在一定差異，細菌來源的多屬于中性酶，真菌來源的多為酸性酶。

表4 部分微生物產β-甘露聚糖酶及其酶學特性

3.2 甘露聚糖酶的應用

3.2.1 甘露聚糖酶在飼料工業(yè)中的應用

甘露聚糖酶可降解β-D-甘露聚糖、破壞植物性飼料細胞壁，使營養(yǎng)物質與消化酶充分接觸，提高動物內源酶(如胰蛋白酶、淀粉酶等)的活性，消除抗營養(yǎng)因子的作用，降低動物消化道內容物黏稠度，改善腸道微生物環(huán)境，改善動物的健康狀況，促進生長，減少糞便排泄，減輕環(huán)境污染。

3.2.2 甘露聚糖酶用作工具酶

在復雜多糖中常常有β-甘露糖苷鍵存在，作為工具酶添加β-甘露聚糖酶將其切除，再測定水解產物中各組分的含量和類型，進一步進行分析便可推測多糖物質可能的結構。

此外，β-甘露聚糖酶可用于食品的加工貯藏和果汁澄清，是一種優(yōu)質的食品添加劑。也可應用于紙漿的漂白工藝、洗滌工業(yè)以及紡織工業(yè)，還可用作油井石油壓裂液的優(yōu)質生物破膠劑，具有高效、價廉、適用范圍廣且對地層傷害小等優(yōu)點。

4 結論

本研究從枯草芽孢桿菌基因組中克隆出中性甘露聚糖酶基因，采用定點突變、重疊PCR酶切和連接等方法，體外構建重組表達載體，利用畢赤酵母表達系統(tǒng)高效穩(wěn)定地表達甘露聚糖酶，最適作用溫度和pH值分別是40℃和6.0，搖瓶培養(yǎng)誘導表達48 h后產酶活性為120 U/ml，為枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶的應用提供參考。