趙麗珺，謝 晶，喬麗君

冷卻豬肉中特定腐敗菌的靶向篩選

趙麗珺，謝 晶*，喬麗君

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

根據(jù)有氧包裝冷卻豬肉中特定腐敗菌的種類特點(diǎn)和致腐特性，以假單胞菌（Pseudomonas sp.）和腸桿菌（Enterobacteriaceae）為目標(biāo)菌建立篩選模型，同時結(jié)合簡單的生理生化鑒定確保篩選方向。以托盤包裝冷卻豬肉貯藏末期腐敗菌為菌源，用鉻天青（chromeazurol S，CAS）嗜鐵素檢測平板法，從假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基上分離的116 株菌中篩選到86 株產(chǎn)嗜鐵素的腐敗菌；用氨基酸脫羧酶檢測管從雙層結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBDA）平板上分離的66 株菌中篩選到21株產(chǎn)氨基酸脫羧酶腐敗菌。采用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）為報告菌再從上述腐敗菌中篩選出產(chǎn)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，N-AHLs）的菌株（產(chǎn)嗜鐵素的51 株，產(chǎn)氨基酸脫羧酶的19 株）。根據(jù)實(shí)驗需要，選取其中部分菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，最后得到產(chǎn)嗜鐵素和AHLs的假單胞菌7株，產(chǎn)氨基酸脫羧酶和AHLs的腸桿菌科菌4株，為靶向抑菌防腐提供了研究基礎(chǔ)。

冷卻豬肉；假單胞菌；腸桿菌；N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯；嗜鐵素；氨基酸脫羧酶

冷卻肉逐漸成為我國居民肉品消費(fèi)主流，但是貨架期短始終制約著冷卻肉的發(fā)展。微生物是引起冷卻肉腐敗的最主要因素，嗜冷假單胞菌在冷卻肉有氧貯藏過程中始終是優(yōu)勢菌，它分泌嗜鐵素吸收環(huán)境中的鐵從而抑制其他菌的生長[1-2]。腸桿菌對于肉品腐敗風(fēng)味的形成具有很大貢獻(xiàn)[3-4]，氨基酸在腸桿菌分泌的氨基酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生相應(yīng)的生物胺，是肉品的典型腐敗物質(zhì)。腐敗菌還能分泌一種被稱為自誘導(dǎo)物（autoinducer，AI）的小分子信號分子，當(dāng)這種信號分子積累到一定閾值時能使細(xì)菌表現(xiàn)出某些特定的生理功能，如抗生素和生物膜的形成等，這種現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[5]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserinelactones，AHLs）是由革蘭氏陰性菌分泌的一類信號分子[5]，目前已發(fā)現(xiàn)這類信號分子與食品腐敗密切相關(guān)，一些與食品腐敗相關(guān)基因的表達(dá)可能受到AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)的調(diào)控[6-9]。

本實(shí)驗根據(jù)不同特定腐敗菌的致腐特性分別建立篩選模型，篩選出產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌和具有氨基酸脫羧酶的腸桿菌，再從中篩選出產(chǎn)AHLs的菌株，篩選過程中結(jié)合簡單生理生化鑒定確保篩選方向，最后經(jīng)過16S rDNA鑒定，為靶向抑菌防腐提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬大排里脊購自農(nóng)工商超市，30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室，分成100 g左右1 份的肉塊置于塑料托盤上，聚乙烯膜包裝后于（4±1）℃貯藏。

根癌農(nóng)桿菌NTL4（PZLR4），含PtraI-lacZ融合基因和traR基因，能感受外源AHLs并顯示藍(lán)色，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基、氧化酶試劑 青島海博科技有限公司；瓊脂糖、哌嗪-1,4-二乙磺酸、鉻天青、酸水解酪蛋白氨基酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（≥98%） 美國Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；TaqTM試劑盒日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E200生物顯微鏡 日本尼康公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；Mastercycler?proS PCR儀 德國Eppendorf公司；Sub-cell?GT核酸電泳儀、Gel DocTMXR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌總數(shù)的測定

分別于0、3、4、5 d取樣，按照GB4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[10]在無菌超凈臺中每份取25 g肉樣進(jìn)行菌落總數(shù)測定，每次3 份。當(dāng)菌落總數(shù)達(dá)到106～107CFU/g時，停止檢測，此時的菌懸液作為腐敗菌分離篩選的原始菌液。

1.3.2 產(chǎn)嗜鐵素假單胞菌的篩選

取適當(dāng)稀釋度的原始菌液涂布于假單胞菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基表面，無菌風(fēng)吹干后25 ℃倒置培養(yǎng)36～48 h。待菌落長出后，挑取特征菌落分別點(diǎn)接于改良假單胞菌瓊脂平板（酸水解酪蛋白氨基酸2.0 g、無水MgCl20.14 g、K2SO40.1 g、甘油1.0 g、瓊脂粉1.5 g、pH 7.1，蒸餾水100 mL）上，25 ℃培養(yǎng)48 h。按照Pérez-Miranda等[11]的方法制備嗜鐵素檢測瓊脂培養(yǎng)基，待冷卻到50 ℃左右，倒入上述培養(yǎng)好的假單胞菌平板上，靜置冷卻2 h，觀察上層嗜鐵素檢測平板的顏色變化。周圍產(chǎn)生變色圈的菌落為嗜鐵素產(chǎn)生菌。

1.3.3 產(chǎn)氨基酸脫羧酶腸桿菌的篩選

取適當(dāng)稀釋度的原始菌液加于無菌平皿中，倒入冷卻至50 ℃左右的VRBDA瓊脂培養(yǎng)基混合均勻。凝固后再倒入一層VRBDA瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)36～48 h。挑取培養(yǎng)基內(nèi)部的單菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)液分別加入賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸脫羧酶檢測管[12]，同時以不接種的檢測管為對照，每管上層滴加一層無菌液體石蠟，37 ℃培養(yǎng)3 d，每隔12 h觀察并記錄培養(yǎng)基顏色變化。檢測管呈紫色為氨基酸脫羧酶陽性，黃色為陰性，空白管應(yīng)為黃色。

1.3.4 產(chǎn)AHLs菌株的篩選

將涂布有5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB平板平均分成兩份，兩塊瓊脂間隔0.3 cm。采用平板劃線法[6]對上述篩選出來的腐敗菌進(jìn)行AHLs檢測。選取產(chǎn)AHLs能力較強(qiáng)的菌株在各自選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化（3 次以上）后進(jìn)行生化鑒定。

1.3.5 腐敗菌的簡單生化鑒定

根據(jù)肉中微生物鑒定程序[4]，在腐敗菌篩選過程中進(jìn)行革蘭氏染色[13]、顯微鏡觀察、氧化酶實(shí)驗[12]和葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗[12]。選取致腐能力和產(chǎn)AHLs能力均較強(qiáng)的疑似假單胞菌和疑似腸桿菌科菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。

1.3.6 腐敗菌的16S rDNA鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌通用引物27F和1492R（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）以細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，引物序列如下：上游引物（27F）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物（1492R）：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

50 μL PCR反應(yīng)體系包括：0.25 μL Taq（5 U/mL），5 μL 10×PCR buffer（Mg2+plus），4 μL dNTP mixture（各2.5 mmol/L），引物（10 μmol/L）各2 μL，100～150 ng模板DNA，補(bǔ)無菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST搜索相似序列。采用MAGE4.0軟件進(jìn)行序列比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗1 000 個副本。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻豬肉4 ℃貯藏過程中細(xì)菌總數(shù)的變化

冷卻豬肉4 ℃貯藏過程中細(xì)菌總數(shù)變化如圖1所示。

圖1 冷卻豬肉4 ℃貯藏過程中細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.1 Change in total viable counts (lg(CFU/g)) in chilled pork during storage at 4 ℃

2.2 產(chǎn)嗜鐵素假單胞菌的分離篩選

圖2 篩選產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌Fig.2 Screening of siderophere-producing Pseudomonas

嗜鐵素根據(jù)與鐵離子配位點(diǎn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為鄰苯二酚型、異羥肟酸型和α-羧酸型[15-16]。還有一些嗜鐵素是“復(fù)合型”，比如假單胞菌產(chǎn)生的膿菌素（pyoverdins）包含了鄰苯二酚基和異羥肟酸基兩種鐵離子配位點(diǎn)[11]。嗜鐵素檢測培養(yǎng)基中Fe3+與鉻天青（chromeazurol S，CAS）和十六烷基三甲基溴化銨形成藍(lán)色復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物中的Fe3+被鄰苯二酚型嗜鐵素絡(luò)合時，培養(yǎng)基由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙划?dāng)Fe3+被異羥肟酸類嗜鐵素絡(luò)合時，培養(yǎng)基由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色[11]。因此能使嗜鐵素檢測瓊脂由藍(lán)色變?yōu)樽仙蜷冱S色的菌落為嗜鐵素產(chǎn)生菌。從假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取的116 株菌中有86 株產(chǎn)生嗜鐵素，并都是產(chǎn)生橘黃色暈圈，但各自產(chǎn)生能力不同（圖2）。

鐵是大多數(shù)微生物生長所必需的微量元素，環(huán)境和動植物中的鐵大多結(jié)合在不溶性化合物上，因此許多微生物進(jìn)化出了高度特異的鐵鰲合系統(tǒng)，它們通常靠產(chǎn)生嗜鐵素來奪取環(huán)境中的鐵[1]。Brown等[17]從腐敗牛奶中分離到20 株產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌，其中14 株產(chǎn)生的嗜鐵素是膿菌素。膿菌素也是一種黃綠色熒光色素，它是產(chǎn)熒光假單胞菌，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[18]，以及隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis）[19]在缺鐵條件下產(chǎn)生的一個重要特征[20]。熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和隆德假單胞菌都是肉制品冷藏過程中常見的假單胞菌[19-21]。假單胞菌還能產(chǎn)生其他種類的嗜鐵素，如綠膿桿菌螯鐵蛋白（pyochelin）和喹啉菌素（quinolobactin），甚至還可以利用外源的嗜鐵素獲取環(huán)境中的鐵[22]。但是假單胞菌產(chǎn)生的膿菌素不能被本屬外的其他細(xì)菌利用，使得假單胞菌在鐵的利用上比其他細(xì)菌更有競爭優(yōu)勢，從而抑制了其他細(xì)菌的生長[23]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）也可以產(chǎn)生嗜鐵素，但在鐵限制的情況下能被鐵攝取能力更強(qiáng)的假單胞菌強(qiáng)烈抑制[24]。嗜鐵素的產(chǎn)生可能是假單胞菌成為優(yōu)勢菌的原因之一。假單胞菌中群體感應(yīng)系統(tǒng)和鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)著多種生理功能（如脂肪酶和蛋白酶）的表達(dá)[25-26]，而膿菌素介導(dǎo)的鐵吸收系統(tǒng)是細(xì)菌鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。嗜鐵素與鐵結(jié)合后形成的復(fù)合物可以通過與鐵抑制外膜蛋白受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，一旦特異抗體與鐵抑制外膜蛋白結(jié)合后就能阻遏鐵的吸收，干擾細(xì)菌鐵調(diào)節(jié)系統(tǒng)，抑制微生物生長，從而延緩微生物引起的食品腐敗[17]。因此膿菌素介導(dǎo)的鐵吸收系統(tǒng)也是一個潛在的食品防腐保鮮靶點(diǎn)。

2.3 產(chǎn)氨基酸脫羧酶的腸桿菌的分離篩選

耐冷的腸桿菌，如蜂房哈尼夫菌（Hafnia alvei）、變形斑沙雷菌（Serratia proteamaculans）、成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans）等，雖然菌體數(shù)量不多，但是對肉及肉制品腐敗風(fēng)味的形成過程中具有重要作用[3]。生物胺是肉制品腐敗的特征產(chǎn)物，冷卻豬肉貯藏過程中，微生物數(shù)量與尸胺、亞精胺顯著相關(guān)[27]，腐胺也是肉制品腐敗產(chǎn)生的主要生物胺。因此本實(shí)驗對尸胺、亞精胺和腐胺分別對應(yīng)的氨基酸脫羧酶：賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選。腸桿菌科菌屬于兼性厭氧菌，雙層瓊脂降低了培養(yǎng)基中氧分壓，一些好氧菌難以生長，從而提高了腸桿菌科菌的檢出機(jī)率。圖3是E17和E52兩株菌培養(yǎng)48 h后氨基酸脫羧酶檢測管培養(yǎng)基的變化。E17和E52由于含有精氨酸脫羧酶能催化培養(yǎng)基中精氨酸產(chǎn)生堿性的精胺或亞精胺，從而使培養(yǎng)基呈深紫色，而不含氨基酸脫羧酶的檢測管呈黃色或黃綠色。從VRBDA雙層平板中挑取的66 株菌中有2 株精氨酸和賴氨酸脫羧酶均呈陽性，17 株僅有精氨酸脫羧酶陽性，2 株僅有賴氨酸脫羧酶陽性，沒有檢測到鳥氨酸脫羧酶陽性菌株。

圖3 37 ℃培養(yǎng)48 h后氨基酸脫羧酶檢測管的變化Fig.3 Change in decarboxylasedetection vials after incubation at 37 ℃for 48 h

2.4 產(chǎn)AHLs腐敗菌的篩選

本實(shí)驗以根癌農(nóng)桿菌為報告菌，采用平板劃線法檢測腐敗菌產(chǎn)生AHLs的情況。檢測結(jié)果（圖4）表明，86 株產(chǎn)嗜鐵素菌株中有51 株產(chǎn)AHLs，其中有37 株產(chǎn)AHLs能力較強(qiáng)（歸為P組）；21 株氨基酸脫羧酶陽性菌株中有19 株產(chǎn)AHLs（歸為E組）。

圖4 采用根癌農(nóng)桿菌為報告菌平板劃線法篩選產(chǎn)AHLs的部分腐敗菌Fig.4 Agar plate screening for the production of AHLs in spoilage bacteria using Agrobacterium tumefaciens

細(xì)菌信號分子的報告菌（又稱傳感菌）檢測法由于操作簡單，成本低而常用于大量的篩選工作。目前常用的報告菌有紫色桿菌（Chromobacterler violaceum）CV026，主要對短鏈、C-3沒有取代基的AHLs比較敏感[28]。另一種常用的報告菌是根癌農(nóng)桿菌，含PtraI-lacZ融合基因和traR基因，能感受外界AHLs產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，水解培養(yǎng)基中的X-Gal形成藍(lán)色產(chǎn)物[29]。根癌農(nóng)桿菌的traR基因?qū)︴；鶄?cè)鏈長度為C6～C14的AHLs敏感，尤其對C-3為羰基取代基的AHLs，即3-oxo-N-acyl-homoserine lactones最為敏感[6,30]，其檢測范圍要比紫色桿菌廣[6]。食品中產(chǎn)生AHLs信號分子的腐敗菌主要是假單胞菌和腸桿菌，其中蜂房哈尼夫菌（Hafnia alvei）是產(chǎn)生AHLs的主要腸桿菌，產(chǎn)生的信號分子主要是根癌農(nóng)桿菌PZLR4敏感的3-oxo-C6HSL[7,9]。不同種的假單胞菌產(chǎn)生的信號分子結(jié)構(gòu)可能不同，C6HSL、3-oxo-C12HSL和3-oxo-C6HSL是假單胞菌中常存在的幾種AHLs[31]，這些信號分子都能被根癌農(nóng)桿菌檢測到。

2.5 腐敗菌的簡單生化鑒定

選擇性培養(yǎng)基和篩選過程中的選擇性培養(yǎng)條件（比如培養(yǎng)溫度）并不能完全淘汰其他非目標(biāo)菌。Arnaut-Rollier[21]在分離冷卻雞肉假單胞菌時發(fā)現(xiàn)假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基上有約15%的菌株不是假單胞菌，主要為一些氧化酶陰性細(xì)菌。而在假單胞菌目前的分類中除了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）外，其余的種均為氧化酶陽性細(xì)菌[32]。丁香假單胞菌是一種植物致病菌，主要定植于植物根際[26]，未見有在肉品中發(fā)現(xiàn)該菌的報道。根據(jù)表1中假單胞菌和腸桿菌科菌的生理生化特征進(jìn)行簡單鑒定的目的是淘汰非目標(biāo)菌，并適時改進(jìn)篩選模型，保證篩選方向的正確性。經(jīng)過生理生化鑒定，從P組中淘汰了11 株非假單胞菌，包括2 株球菌，6 株氧化酶陰性菌和3 株發(fā)酵產(chǎn)酸的桿菌，得到26 株疑是假單胞菌。從E組中淘汰9 株非腸桿菌科菌，包括1株球菌和8 株氧化酶陽性菌，得到10 株疑是腸桿菌科菌。圖5A、B分別是P組和E組目標(biāo)菌的典型細(xì)胞形態(tài)。

表1 假單胞菌和腸桿菌生理生化特征[18]及鑒定結(jié)果Table 1 Identification and biochemical and physiological properties[18]of ofPseudomonas and Enterobacteriaceae

圖5 冷卻豬肉中腐敗菌細(xì)胞顯微形態(tài)（×1 600）Fig.5 Cell morphology of microorganisms isolated from chilled pork（× 1 600）

2.6 腐敗菌的16S rDNA鑒定

根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果以及后續(xù)實(shí)驗需要，選取7 株產(chǎn)嗜鐵素能力較強(qiáng)的疑是假單胞菌和4 株氨基酸脫羧酶陽性反應(yīng)較強(qiáng)的疑似腸桿菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。細(xì)菌總DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸電泳如圖6所示。將待測菌16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，從搜索結(jié)果中選取相似性98%以上的代表菌株14～23 株，用MAGE4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7～9。選取的7 株疑似假單胞菌經(jīng)16S rDNA鑒定均為假單胞菌屬（圖7）。實(shí)驗篩選得到的具有氨基酸脫羧酶活性的腸桿菌科菌有拉恩氏菌（Rahnella sp.）和泛菌（Pantoea sp.）。E17和E52的16S rDNA序列與拉恩氏菌和愛文氏菌（Ewingella sp.）的16S rDNA均具有很高的相似性，但系統(tǒng)發(fā)育樹中這2株菌與拉恩氏菌在同一分支（圖8），因此將其歸為拉恩氏菌屬。E100和E112屬于泛菌屬（圖9）。泛菌屬是由Gavini于1989年將草生歐文氏菌（Erwinia herbicoli）、雞血藤歐文氏菌（Erwinia milletiae）和一部分成團(tuán)腸桿菌組成的一個新屬[32]。泛菌的模式菌是成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），也被稱為成團(tuán)桿菌[32]，是冷卻肉及肉制品貯藏過程中常見的腸桿菌科菌[3]。表2總結(jié)了11 株腐敗菌的鑒定結(jié)果及其16S rDNA的GenBank登錄號。

圖6 細(xì)菌基因組和16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸電泳檢測結(jié)果Fig.6 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products and total DNA

表2 冷卻豬肉中具有特定致腐能力腐敗菌的篩選及鑒定結(jié)果Table 2 Isolation and identification of bacteria with spoilage potential in chilled pork

圖7 pp7、pp102、pp103、pp106、pp109、pp110和pp113 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strains pp7, pp102, pp103, pp106, pp109, pp110 and PP113 based on 16S rDNA gene sequences

圖8 E17和E52 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strains E17 and E52 based on 16S rDNA gene sequences

革蘭氏染色、氧化酶反應(yīng)和葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗操作簡單，實(shí)驗表明在篩選過程中以選擇性培養(yǎng)基為起點(diǎn)，加入這些簡單的生理生化鑒定能夠淘汰非目標(biāo)菌，減輕后續(xù)鑒定工作量，還可以根據(jù)鑒定結(jié)果適時調(diào)整篩選策略。從假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基上挑取的37 株待測菌經(jīng)過簡單生理生化鑒定，淘汰了約30%非假單胞菌，主要為一些氧化酶陰性細(xì)菌。從腸桿菌選擇性培養(yǎng)基——VRBDA培養(yǎng)基上挑取的19 株待測菌經(jīng)過簡單生理生化鑒定，有47%為非腸桿菌，主要是一些氧化酶陽性菌（約占42%）。16S rDNA鑒定結(jié)果也說明這些簡單的生理生化鑒定起到了很好的“篩子”作用。

經(jīng)過重重篩選，根據(jù)后繼實(shí)驗需要最后得到了7 株產(chǎn)嗜鐵素和AHLs能力較強(qiáng)的假單胞菌，產(chǎn)精氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶，并且產(chǎn)AHLs能力較強(qiáng)的腸桿菌科菌1 株，產(chǎn)精氨酸脫羧酶和AHLs的腸桿菌科菌3 株。

圖9 E100和E112 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strains E100 and E112 based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié) 論

假單胞菌選擇性培養(yǎng)基上挑取的116 株腐敗菌中有86 株能產(chǎn)生嗜鐵素，但各自產(chǎn)生能力不同，其中又有51 株能產(chǎn)生信號分子AHLs。VRBDA培養(yǎng)基中挑取的66 株腐敗菌中有21 株氨基酸脫羧酶檢測呈陽性，其中有19 株能產(chǎn)生AHLs。冷卻豬肉中大多數(shù)腐敗菌能分泌AHLs，與文獻(xiàn)[6]報道一致。

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Targeted Screening of Specific Spoilage Organisms in Chilled Pork

ZHAO Li-jun, XIE Jing*, QIAO Li-jun
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Much evidence showed that quorum sensing (QS) is involved in food spoilage. Inhibition of QS has the potential to provide a new targeted preservation procedure. A screening model based on the spoilage potential and characteristics of speci c spoilage organisms in chilled pork was set up. Several biochemical and physiological tests were applied to exclude undesired strains. Eighty-six strains with siderophere-producing capability were isolated from 116 strains picked up from Pseudomonas CFC-selective medium with chromeazurol S (CAS) agar assay. Twenty-one strains able to produce decarboxylase were isolated from 66 strains picked up from double-layer violet red bile dextrose agar (VRBDA) plate with decarboxylase detection vial assay. Furthermore, the capability of these isolates (86 siderohere+and 21 decarboxylase+isolates) to produce N-acyl homoserine lactones (AHLs) was evaluated with a biosensor strain (Agrobacterium tumefaciens). It was found that 51 siderosphere+strains and 19 decarboxylase+strains could produce AHLs. Eleven of these isolates were identified based on 16S rDNA, including seven Pseudomonas sp. strains able to produce siderophere and AHLs and four Enterobacteriaceae stains able to produce decarboxylase and AHLs. These strains will be useful for the further studies on target preservation.

chilled pork; Pseudomonas; Enterobacteriaceae; N-acyl homoserine lactones; siderophere; decarboxylase

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0174-07

10.7506/spkx1002-6630-201409035

2013-06-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD24B02）；上海市教育委員會重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目（J50704）；上海海洋大學(xué)研究生科研基金項目（A-0209-13-0900009）

趙麗珺（1979—），女，博士研究生，研究方向為食品貯藏保鮮。E-mail：lankunzhao@hotmail.com

*通信作者：謝晶（1968—），女，教授，博士，研究方向為食品保鮮與食品冷凍冷藏。E-mail：jxie@shou.edu.cn