■王慶吉 唐 薇 羅亞軍 陳立穎 王 晉 張 蕾 劉海洋 王曉蘭 關(guān)洪斌

（山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海264209）

研究表明，刺參的免疫能力及存活率與自身的蛋白質(zhì)的含量有極為密切的關(guān)系。因此我們決定從根源著手，對刺參的食物中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測定研究，探究其與刺參的生長免疫能力以及成活率之間的關(guān)系。為了排除動物蛋白中其它活力因子對研究的影響，試驗(yàn)采用了富含蛋白的植物飼料。希望通過此項(xiàng)研究能夠?qū)Υ虆⑹袌龅目茖W(xué)飼養(yǎng)有所幫助，為提高刺參的存活率提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與條件

實(shí)驗(yàn)研究用的刺參全部為購自山東省威海市永泰刺參養(yǎng)殖場的1齡參。體長為6～7 cm，活潑健康，雌雄兼?zhèn)涔灿?jì)120只。將其平均分配到4個相同的塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)(箱體長60 cm、寬45 cm、高50 cm)，每個箱內(nèi)放置有兩片瓦片(用海水清洗并浸泡了48 h)及一塊取自海里的石頭，而且每個箱內(nèi)還都配備有一個氧氣泵(用以不斷供氧)、一支溫度計(jì)(隨時測定水溫)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼料的準(zhǔn)備

海泥粉來自威海市榮成成山海參養(yǎng)殖場；市售海藻粉：山東濱州產(chǎn)，主要成分鼠尾藻、馬尾藻、海青菜、海草；滸苔和大葉藻采自威海市小石島海灘；火棘果采自威海市山東大學(xué)校園。用摘去雜質(zhì)洗凈高溫烘干，于高速中藥粉碎機(jī)ZN500A粉碎過60目篩，冰箱保存?zhèn)溆?。用海藻、滸苔、火棘果、大葉藻這四種含高蛋白的植物作為飼養(yǎng)刺參的餌料，分別投放到刺參1組、2組、3組、4組。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

將刺參進(jìn)行1周馴化飼養(yǎng)后，放在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中饑餓24 h，測定各組海參的初體重，每日定時投餌、換水、清理糞便，不斷充氧，保持水體氧含量、pH值、鹽度、溫度等適宜且穩(wěn)定。

1.2.3 清理及換水

每天換水前用虹吸法抽取箱底及石頭和瓦片表面的刺參排泄物及餌料殘?jiān)?，測定殘食量。每天下午2:30準(zhǔn)時進(jìn)行換水，每次抽出箱內(nèi)總水量的三分之一，再加入等量的靜置了48 h并用六層紗布過濾過的清澈海水。

1.2.4 投餌

每天投喂一次，換水后進(jìn)行，采用飽食量投喂法，每天以海參體重的3.0%稱取餌料，4個水箱分別投放四種不同的餌料。先用處理好的清澈海水將容器內(nèi)的餌料攪勻，而后均勻的全部撒入水箱內(nèi)。

1.3 測定數(shù)據(jù)

1.3.1 過氧化酶（CAT）活性的測定

用紫外吸收法進(jìn)行CAT活性的測定。

式中：ΔA240——As0-(As1+As2)/2;

As0——加入失活酶液的對照管吸光值；

As1，As2——樣品管吸光值；

Vt——粗酶提取液總體積（ml）；

Vl——測定用粗酶提取液體積（ml）；

FW——樣品鮮重（g）；

0.1——A240每下降0.1為1個酶活單位（U）；

t——過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）。

本實(shí)驗(yàn)以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)。蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[4]。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力測定

采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶（SOD）活力。

式中：A——酶活力[酶活力單位/(g·h)]；

V——酶提取液體積（μl）；

B——一個酶活力單位的酶液量（μl）（抑制NBT光還原的相對百分率為50%時所加入的酶液量，以該酶液量作為1個酶活單位）；

W——樣品鮮重（g）；

T——反應(yīng)時間（min）。

1.3.3 溶菌酶含量的測定

用溶菌酶檢測試劑盒（南京建成）進(jìn)行含量測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel與Spss對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA）及卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛋白含量不同的刺參餌料中的蛋白含量

分別喂食海藻粉、滸苔粉、火棘果粉、大葉藻粉的刺參體壁蛋白的含量情況如圖1所示。四種餌料本身的蛋白含量如圖2所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果很容易看出，喂食不同的餌料，刺參體壁蛋白的含量各不相同，其中喂食大葉藻的刺參(即第四組)蛋白含量與其它組的刺參的蛋白含量有顯著的差異（P＜0.05），而且體壁蛋白含量與餌料蛋白的含量成正相關(guān)，餌料中蛋白的含量直接影響刺參體壁蛋白的含量，二者之間有緊密的聯(lián)系。

圖1 四種餌料中蛋白質(zhì)的含量

圖2 刺參體壁蛋白質(zhì)含量

2.2 蛋白含量不同的刺參的重量

平均從每個箱內(nèi)抽取5只生長相對較好的刺參進(jìn)行稱重（防止隨機(jī)抽取而取到已排腸的刺參），喂食四種餌料的海參的重量如表1所示。喂食大葉藻的刺參的體重顯著高于其他組（P＜0.05）。喂食火棘果粉的刺參體重也相對較大，但生長的不均勻。而喂食海藻粉和滸苔粉的刺參的體重則差距不大。

表1 喂食不同餌料的刺參的重量（g）

2.3 蛋白含量不同的刺參CAT、SOD的活性及溶菌酶的含量

蛋白含量不同的刺參CAT、SOD的活性及溶菌酶的含量如圖3～圖5。從圖中可以看出SOD的活性以及溶菌酶的含量各組間有顯著差異（P＜0.05），SOD活性以及溶菌酶的含量整體變化趨勢與刺參蛋白含量變化相同，而CAT的活性無明顯差異（P＞0.05），這里不予探究。

圖3 刺參中SOD活性

圖4 刺參中溶菌酶含量

圖5 刺參中CAT活性

2.4 蛋白含量不同的刺參的成活率

蛋白含量不同的刺參的成活率如圖6，從圖6可以看到，4組刺參的成活率的變化趨勢與刺參蛋白的含量相同。這也可以進(jìn)一步說明了刺參蛋白質(zhì)的含量與免疫能力有著密切關(guān)系。

圖6 四組刺參的成活率

3 討論

刺參屬于海洋棘皮動物，其免疫防御機(jī)制是通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)共同完成的。目前試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成刺參的主要營養(yǎng)成分中蛋白質(zhì)的含量所占的比重是最大的。作為生長所需要的營養(yǎng)素之一，蛋白質(zhì)的含量與刺參的生長有著極為密切的關(guān)系，并且能在一定程度上反映出刺參生長能力及免疫能力，因此研究刺參餌料中蛋白質(zhì)含量對刺參生長時體內(nèi)蛋白含量的影響進(jìn)而可以了解餌料中蛋白含量對刺參免疫能力的影響。此項(xiàng)研究不僅對開發(fā)新型餌料配方以增強(qiáng)刺參的免疫能力，提高存活率進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義，同時也能為刺參的免疫機(jī)制的研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

蛋白質(zhì)是刺參生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是刺參的免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其含量的多少一定程度上決定了機(jī)體免疫能力的大小，與機(jī)體的免疫力相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，食物中蛋白質(zhì)的含量越大，刺參的蛋白含量就越高，個體生長的也越大。這說明機(jī)體發(fā)育的較好。但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)超過一定的限度，免疫能力卻不隨之一直升高。本實(shí)驗(yàn)過程中，在剛開始喂養(yǎng)的過程中，食物中蛋白含量過高，刺參反而容易生病，喂食大葉藻的幼參即第4組，在實(shí)驗(yàn)開始的第一周內(nèi)，死亡數(shù)目明顯高于其他組。這一結(jié)果與李勇等的研究結(jié)果一致，這很可能是由于餌料中過高的蛋白含量不僅會加重動物機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)，抑制免疫活性的發(fā)揮，而且會大大增加機(jī)體的氮排泄量，導(dǎo)致水體污染，進(jìn)而降低免疫能力，提高感染疾病的幾率。

蛋白質(zhì)也是機(jī)體免疫反應(yīng)的直接參與者，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一些蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小肽對動物的體液免疫和細(xì)胞免疫可產(chǎn)生有利的影響。Krogdahl等研究發(fā)現(xiàn)，小肽可提高海洋生物白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)能力，增加超氧離子的產(chǎn)量，加強(qiáng)對異物的殺滅作用。有實(shí)驗(yàn)表明，小肽可以顯著增強(qiáng)海洋生物的非特異性免疫能力。同樣也有實(shí)驗(yàn)指出，餌料中的蛋白被分解成氨基酸繼而被吸收，而機(jī)體內(nèi)氨基酸的含量、種類以及它們之間的配比也會顯著影響刺參的免疫功能，然而針對特定的氨基酸和機(jī)體免疫的相關(guān)性，僅有少量報道，且多數(shù)研究集中在特定的氨基酸營養(yǎng)對機(jī)體生長效果的作用方面。本實(shí)驗(yàn)中，選用了蛋白含量不同的4種餌料。一定范圍內(nèi)蛋白越多，進(jìn)入刺參體內(nèi)分解的也就越多，刺參的免疫力也就越強(qiáng)。但是，超過一定范圍，蛋白含量由于過高，其蛋白的三級結(jié)構(gòu)有可能過于復(fù)雜而不易被分解，所以免疫力不強(qiáng)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與此相同。但是，在喂這組高蛋白飼料中存活下來的刺參即第四組刺參，生長發(fā)育卻明顯要好于其他三組，更不容易生病，對于這種結(jié)果，作者認(rèn)為是生長發(fā)育好的刺參其消化系統(tǒng)得到進(jìn)一步的完善，所以蛋白含量過高的食物也容易被消化，可被機(jī)體利用，機(jī)體的生長也就更好，免疫力更強(qiáng)。從這種角度看，我們的結(jié)果也與Krogdahl等的結(jié)論相同。

SOD是無脊椎動物機(jī)體內(nèi)的重要的抗氧化酶，它能夠及時清除吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性自由基，從而使機(jī)體免受損傷。CAT普遍存在于植物的所有組織中，所以可以隨餌料進(jìn)入到機(jī)體內(nèi)，CAT的活性可影響機(jī)體代謝強(qiáng)度及抗病能力。

本實(shí)驗(yàn)中，SOD活性隨著刺參體內(nèi)蛋白含量的升高而增大，這說明了隨著刺參的不斷生長發(fā)育，SOD逐漸增多，抗氧化作用不斷增強(qiáng)，SOD逐漸成為主要的抗氧化酶，刺參的免疫能力也逐漸增大，這一結(jié)果與田丹等研究結(jié)論相同。刺參體內(nèi)的CAT含量比較均一，各組之間并沒有太大差異，無明顯現(xiàn)象，故在這里不予探討。

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，其本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，刺參內(nèi)溶菌酶的含量與蛋白質(zhì)的含量有明顯的聯(lián)系，蛋白質(zhì)含量高于其它組的刺參溶菌酶的含量也會高于其它組。溶菌酶的相對分子質(zhì)量約為16 000，與常見金屬離子和化學(xué)試劑有良好的配伍性。有實(shí)驗(yàn)證明從刺參中分離純化的溶菌酶具有廣譜殺菌功能，即對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌細(xì)胞壁均有溶菌作用。這一點(diǎn)也證明了溶菌酶對刺參免疫力的重要性。

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)著重研究了4種蛋白含量不同的植物餌料對刺參生長和免疫及存活率的影響。前人于此少有報道。通過本次實(shí)驗(yàn)研究，使用蛋白含量不同的餌料飼喂的刺參蛋白質(zhì)的含量明顯不同，免疫能力存在著顯著地差異，尤其是SOD活性及溶菌酶活性的差別較為明顯。這說明食物中的蛋白不僅可以保證刺參健康發(fā)育成長，同時也能促使刺參體內(nèi)的免疫系統(tǒng)的各項(xiàng)重要的免疫組分趨于成熟，使免疫功能更加健全完善，從而形成良性循環(huán)，刺參能更好地吸收食物中的養(yǎng)分，使刺參能更健康地發(fā)育成長。