張秀云 宋永硯

高脂血癥是心血管疾病(CVD)的主要危險(xiǎn)因素，占人群歸因危險(xiǎn)度的50%以上［1］。降低血脂水平除了調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)體力活動(dòng)、改善生活方式外，藥物治療也是非常重要的手段。目前使用的調(diào)脂藥物包括他汀類、貝特類和煙酸，這些藥物的應(yīng)用為人類心血管疾病的防治作出了巨大的貢獻(xiàn)。但是，傳統(tǒng)降脂藥物存在種類少、價(jià)格高、存在毒副作用等不足［2］。RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為降脂藥物的研發(fā)開辟了一條嶄新的道路。高脂血癥與一系列脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)異常有關(guān)，比如載脂蛋白C-Ⅲ基因高表達(dá)導(dǎo)致高三酰甘油血癥［3］。將RNA干擾技術(shù)用于高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和CVD的治療中，目前國(guó)外已有一系列研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚處于起步階段。

1 RNA干擾技術(shù)體系

1998年，F(xiàn)ire等［4］首次在對(duì)秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象，并將導(dǎo)致基因沉默的雙鏈RNA命名為siRNA。RNA干擾技術(shù)(RNAi)是在天然RNA干擾現(xiàn)象和理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是指人工合成并導(dǎo)入與靶基因同源的雙鏈RNA分子(dsRNA)，在細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)的酶蛋白復(fù)合物相互作用，促使靶基因mRNA降解，導(dǎo)致致病基因功能缺失，從而達(dá)到疾病治療的目的。外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，在Dicer酶的作用下形成長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸的siRNA，siRNA具有突出的5'-磷酸末端和3'-羥基末端。研究表明，盲端siRNA或缺失5'-磷酸基團(tuán)的siRNA不能引起基因沉默效應(yīng)［5］。siRNA中的反義鏈(與靶mRNA序列互補(bǔ))與細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酶蛋白(包括核酸內(nèi)切酶和外切酶)結(jié)合成基因沉默復(fù)合物(RISC)。RISC復(fù)合物在反義RNA的引導(dǎo)下，遵循堿基配對(duì)原則尋找序列互補(bǔ)的mRNA，在核酸內(nèi)切酶的作用下切斷該互補(bǔ)mRNA，切割部位大約在與siRNA反義鏈配對(duì)序列的中部。隨后，mRNA片段被RNA酶進(jìn)一步降解。

RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，不同于反義核酸以及其他形式的基因敲除，其基本特征如下:(1)高效性:RNAi具有放大效應(yīng)［6］;(2)高特異性;(3)ATP依賴性;(4)濃度依賴性;(5)可傳播性;(6)選擇性:siRNA只對(duì)細(xì)胞內(nèi)成熟的mRNA產(chǎn)生作用，對(duì)hnRNA、啟動(dòng)子區(qū)域以及其他基因調(diào)控區(qū)無(wú)沉默效應(yīng);(7)可修飾性:siRNA可通過(guò)膽固醇、磷酸化、生物素等修飾提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性［7］。

2 RNAi技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高脂血癥基因治療中的研究進(jìn)展

2.1 siRNA沉默載脂蛋白基因

載脂蛋白是血漿脂蛋白顆粒的蛋白部分，具有穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構(gòu)、激活脂蛋白代謝酶、識(shí)別脂蛋白受體等功能。根據(jù)與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系可將血漿脂蛋白分為致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白和抗動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白兩大類，致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白包括乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白a［Lp(a)］，抗動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白為高密度脂蛋白(HDL)。在所有致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白顆粒中，均含有一分子載脂蛋白 B(ApoB)，CM 含 ApoB48，VLDL、IDL、LDL 和Lp(a)含 ApoB100，ApoB48和 ApoB100來(lái)自同一基因(APOB)的轉(zhuǎn)錄本，APOB基因定位于人第2號(hào)染色體短臂2p23～24，全長(zhǎng)43 kb。研究顯示，采用RNA干擾技術(shù)沉默APOB基因可以有效地降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿三酰甘油和膽固醇水平［7-10］。

2004年，Soutschek等［7］針對(duì) APOB 基因做了以基因干擾為技術(shù)手段的開創(chuàng)性研究。研究者們首先設(shè)計(jì)了84對(duì)siRNA，在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行篩選，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中5對(duì)siRNA對(duì)APOB基因的敲減率達(dá)70%以上。選取其中2對(duì)(apoB-1-siRNA和apoB-2-siRNA)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了增強(qiáng)siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，對(duì)siRNA有意義鏈3'端進(jìn)行膽固醇修飾，得到 chol-apoB-1-siRNA和 chol-apoB-2-siRNA。修飾后的siRNA在小鼠血清中的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。chol-apoB-1-siRNA和chol-apoB-2-siRNA通過(guò)尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內(nèi)，24 h后肝APOB mRNA分別下降(57±6)%和(36±8)%;空腸 APOB mRNA分別下降(73±10)%和(51±13)%;血漿 ApoB100水平分別下降(68±14)%和(31±18)%。chol-apoB-1-siRNA使小鼠血漿CM下降50%，LDL下降40%，總膽固醇下降(37±11)%，LDL-C下降44%。

裸露核酸片段不易被組織細(xì)胞吸收，必須借助于特定的運(yùn)載體將siRNA運(yùn)送到靶組織。納米脂質(zhì)體(Lipid nanoparticle，LNP)具有安全性高、免疫原性低、操作簡(jiǎn)單、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)。Todin-Strapps等［8］通過(guò)篩選后將3對(duì)活性較高的APOB siRNA［ApoB:(9331)，ApoB:(10168)和ApoB:(9514)］采用納米脂質(zhì)體LNP201包裹，以3 mg/kg的劑量尾靜脈注射Balb/C小鼠，72 h后小鼠肝APOB mRNA下降58% ～80%，血清LDL下降47% ～56%。LNP OCD是Merck公司開發(fā)的第二代脂質(zhì)納米材料。研究者們將其中一對(duì)siRNA［ApoB:(10168)］裝載入LNP OCD，注射高脂血癥模型小鼠，24 h后小鼠肝APOB mRNA下降達(dá)95%，72 h抑制率仍保持在90%以上。血清總膽固醇和非HDL顯著降低，總脂含量下降70%，肝脂肪酸從頭合成途徑中的相關(guān)基因表達(dá)也顯著降低。更為重要的是，單次注射即能使藥效維持3周以上。這些研究結(jié)果被另一項(xiàng)相似的研究［9］所證實(shí)。在這項(xiàng)研究中，研究人員將APOB siRNA采用LNP包裹后靜脈注射C57Bl/6小鼠，肝APOB mRNA、血清ApoB、膽固醇和三酰甘油水平均顯著降低。注射3個(gè)星期后，總膽固醇仍下降76% ～84%，非 HDL-C下降79% ～90%，HDL-C下降67% ～78%。當(dāng)然，使用siRNA沉默APOB基因也帶來(lái)一些負(fù)面作用，比如，APOB基因沉默后肝VLDL顆粒生成減少，脂肪輸出受阻而導(dǎo)致肝脂肪變性［8-9］。

2.2 siRNA沉默載脂蛋白受體基因

脂蛋白受體在脂代謝中也發(fā)揮重要作用，脂蛋白及其殘粒通過(guò)肝細(xì)胞或組織細(xì)胞膜上的受體識(shí)別而被攝取。LDL通過(guò)低密度脂蛋白受體(LDL-R)對(duì)ApoB100的識(shí)別而被吞入細(xì)胞，LDL-R基因功能缺失是導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥的原因之一。IDL(VLDL殘粒)和CM殘粒通過(guò)ApoE與肝細(xì)胞膜上的受體識(shí)別結(jié)合而被清除。清道夫受體B類I型(SR-BI)是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的HDL受體，存在于肝細(xì)胞及固醇類激素合成腺體的細(xì)胞膜上。研究表明SR-BI功能缺失會(huì)導(dǎo)致阻塞性冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、自發(fā)性心肌梗死和嚴(yán)重的心功能不全［11］。另一方面，SR-BI基因過(guò)量表達(dá)使高膽固醇血癥模型小鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度降低［12］。但有趣的是，Demetz等［13］采用siRNA技術(shù)將SR-BI基因沉默后發(fā)現(xiàn)模型家兔動(dòng)脈粥樣硬化程度顯著降低。研究人員以質(zhì)粒載體為介質(zhì)將小發(fā)夾RNA(shRNA)尾靜脈注射動(dòng)脈粥樣硬化模型家兔，每周注射1次，2周后肝SR-BI mRNA下降80%，SR-BI蛋白水平顯著降低，膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移至VLDL/IDL/LDL增強(qiáng);8周后血漿總膽固醇水平顯著降低，動(dòng)脈粥樣硬化程度下降50%。

2.3 siRNA沉默脂質(zhì)合成相關(guān)基因

肝臟是三酰甘油和膽固醇合成的主要場(chǎng)所，通過(guò)siRNA技術(shù)抑制肝臟三酰甘油和膽固醇從頭合成是降低血脂水平的重要方式。VLDL的裝配起始于三酰甘油和ApoB100的結(jié)合。微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTP)將三酰甘油轉(zhuǎn)運(yùn)到ApoB100，形成新生VLDL顆粒。MTP抑制劑可減少肝細(xì)胞VLDL分泌，從而降低血漿三酰甘油及膽固醇水平，但同時(shí)出現(xiàn)脂肪肝［14］。Tep等［15］采用siRNA抑制 MTP表達(dá)，從而抑制VLDL顆粒形成和分泌，同時(shí)還采用siRNA沉默甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)，DGAT2是三酰甘油合成途徑中的第2個(gè)酶，旨在降低血脂水平的同時(shí)抑制肝脂肪變性。研究者們將MTPsiRNA、DGAT2 siRNA和MTP siRNA+DGAT2 siRNA分別注射模型小鼠(單次注射)，2周后血漿非HDL-C和三酰甘油均顯著降低，但僅MTP siRNA+DGAT2 siRNA聯(lián)合組未出現(xiàn)肝脂肪變性，提示多基因沉默可能是減小單基因沉默后毒副反應(yīng)的潛在途徑。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(FATP5)存在于肝細(xì)胞膜上，其功能是轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入肝臟。FATP5基因敲除小鼠高脂膳食干預(yù)后肝脂肪變性程度較對(duì)照組顯著降低，提示FATP5基因沉默可以抵抗肝脂肪變性。然而，Ason等［9］采用siRNA同時(shí)沉默F(xiàn)ATP5基因和 APOB基因后，并沒有觀察到APOB siRNA+FATP5 siRNA聯(lián)合組較APOB siRNA組或FATP5 siRNA組肝脂肪變性程度降低。

2.4 siRNA沉默脂代謝調(diào)節(jié)基因

脂代謝受多種蛋白質(zhì)因子的調(diào)節(jié)，對(duì)調(diào)節(jié)蛋白的基因沉默可使一些脂代謝相關(guān)酶或受體蛋白的數(shù)量及活性發(fā)生改變，從而降低血脂水平。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的影響LDL-R細(xì)胞膜豐度的調(diào)節(jié)蛋白，其結(jié)合在LDL-R上會(huì)促使LDL-R降解。PCSK9基因表達(dá)降低會(huì)增加LDL-R的細(xì)胞膜豐度，從而增加組織細(xì)胞對(duì)LDL的吞噬作用，降低血漿LDL-C水平。Frank-Kamenetsky等［16］針對(duì)PCSK9基因設(shè)計(jì)合成siRNA，納米脂質(zhì)體包裹后對(duì)C57BL/6小鼠和SD大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)PCSK9 mRNA下降50% ～70%，血漿膽固醇水平下降60%。最近，該研究團(tuán)隊(duì)在動(dòng)物試驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展了PCSK9 siRNA藥物的Ⅰ期臨床試驗(yàn)［17］，PCSK9 siRNA 以不同劑量(0.015～0.400 mg/kg)靜脈注射血清膽固醇升高的健康志愿者。與對(duì)照組相比，0.400 mg/kg治療組血漿PCSK9蛋白水平下降70%，血漿LDL-C水平下降40%。試驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，耐受性良好。

3 存在的問題、未來(lái)發(fā)展方向及前景

與RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于其他疾病如腫瘤、病毒性感染等一樣，siRNA在高脂血癥的研究和應(yīng)用中也存在一些問題，這些問題的出現(xiàn)極大地限制了siRNA作為降脂藥物的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。存在的問題主要有:(1)脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)是指siRNA對(duì)非靶基因的沉默，是由于siRNA與非靶基因mRNA部分同源以及核苷酸的擺動(dòng)配對(duì)造成的，如G/U錯(cuò)配;(2)體內(nèi)穩(wěn)定性較差。(3)轉(zhuǎn)染效率低下。人體組織不易攝取外源裸露性核酸，因而藥物siRNA進(jìn)入靶組織的轉(zhuǎn)染效率較低;(4)存在毒副作用。某些siRNA對(duì)人體、組織和細(xì)胞存在一定的毒性，毒性反應(yīng)可能來(lái)自于對(duì)天然免疫系統(tǒng)的激活以及對(duì)非靶基因的沉默。外源siRNA可誘導(dǎo)干擾素(IFNα、IFNβ)和炎癥因子(TNFα、IL-6 等)產(chǎn)生，引起淋巴細(xì)胞和血小板減少，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［18-19］。siRNA還能夠不依賴靶基因?qū)?xì)胞活力產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者生長(zhǎng)抑制。siRNA產(chǎn)生毒副作用具有序列特異性和濃度依賴性，高濃度的siRNA可引起細(xì)胞基因組表達(dá)譜和細(xì)胞表型發(fā)生改變［20］。

針對(duì)siRNA在基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用中存在的問題，未來(lái)的研究和發(fā)展方向應(yīng)包括:(1)探索更有效的siRNA設(shè)計(jì)原則和高通量篩選方法。避開mRNA上容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)或高度折疊的區(qū)域，避開mRNA上與蛋白質(zhì)有相互作用的區(qū)域如3'UTR和5'UTR，這些區(qū)域基因沉默復(fù)合物可能無(wú)法接近并發(fā)揮作用。在符合siRNA設(shè)計(jì)原則的基礎(chǔ)上，針對(duì)靶基因mRNA設(shè)計(jì)盡可能多的siRNA，然后在細(xì)胞水平上進(jìn)行高通量篩選，篩出那些高效、高特異性、副作用小的siRNA進(jìn)一步研究，以減小脫靶效應(yīng)和毒副作用;(2)探索更有效的siRNA修飾方式。目前常用的修飾方式有膽固醇修飾、氟代修飾和甲基化修飾等。修飾部位可以在siRNA鏈的末端或內(nèi)部;可以對(duì)堿基進(jìn)行修飾，也可以對(duì)磷酸核糖骨架進(jìn)行修飾;(3)探索更有效的給藥途徑。將siRNA藥物有效地傳遞到靶組織是基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前常用的給藥途徑有慢病毒載體、納米脂質(zhì)體等;(4)探索多靶點(diǎn)或多基因聯(lián)合治療。對(duì)一條mRNA的多個(gè)靶點(diǎn)，或同時(shí)干擾多條相關(guān)基因，可以減少抗藥性和不良反應(yīng)，產(chǎn)生協(xié)同作用。

近年來(lái)，siRNA應(yīng)用于高脂血癥基因治療的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)正在廣泛而深入地開展。盡管目前還存在一系列有待解決的問題，但隨著研究的深入和各種機(jī)制的闡明，這些不足之處將能得到妥善解決和有效克服，小核酸藥物有望進(jìn)入臨床應(yīng)用，為高脂血癥的治療開辟一條新的途徑。

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