王 曄，劉乃紅，王 銳，楊小榮，李建國，張 策

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見難治性疾病，隨著人們生活水平的提高，高脂肪、高能量的過量攝入，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已成為導(dǎo)致人類死亡的三大原因之一。在發(fā)病過程中，缺血性腦卒中大約占所有腦卒中的80%，可能與腦缺血再灌注后發(fā)生的神經(jīng)元遲發(fā)性死亡密切相關(guān)。然而，目前對腦卒中發(fā)生后的神經(jīng)元損傷機(jī)制尚未闡明，臨床上也無理想的治療手段［1，2］。腦缺血再灌注后，海馬發(fā)生特異性病理學(xué)改變：CA1區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（即腦缺血再灌注2d～3d后光鏡下才見到CA1區(qū)錐體細(xì)胞的死亡），而CA3區(qū)的錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞卻幾乎不受損害。長期以來，認(rèn)為腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡只是一種被動(dòng)的壞死過程。但是近年的研究發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)的細(xì)胞凋亡在腦缺血后海馬遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的發(fā)生過程中具有重要作用［3，4］。目前的研究結(jié)果一致認(rèn)為，NMDA 受體的過度異常激活是腦缺血發(fā)生引起神經(jīng)元損傷的主要原因［5，6］。Eph受體是已知最大的受體酪氨酸激酶家族，共16個(gè)成員，因最初來源于可分泌促紅細(xì)胞生成素的人肝癌細(xì)胞系而得名。Eph－ephrin系統(tǒng)主要參與機(jī)體的發(fā)育過程，如細(xì)胞遷移，軸突導(dǎo)向、血管形成，特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成［7］。ephrin激活Eph的“正向”信號傳遞包括Rho GTPases，MAPK，Src激酶和PI3激酶等多種下游信號通路［8］。其中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs），包括ERK1／2，JNK 和p38 MAPK，參與神經(jīng)元存活和凋亡調(diào)控過程［9］。其中，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1／2是將膜受體接收到的信號轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的蛋白功能和基因表達(dá)變化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)突進(jìn)中的重要組成部分［10，11］。

目前，關(guān)于ephrinB2的報(bào)道主要集中在血管的生成，腫瘤重構(gòu)等方面。在混合培養(yǎng)的原代神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，由外源性的EphB1／FC激活的ephrinB2放大了通過mGlu1 受體介導(dǎo)的NMDA 興奮毒作用［12］。然而，在腦缺血再灌注損傷過程中有關(guān)ephrinB2的作用未見相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究設(shè)想：在腦卒中發(fā)生過程中，ephrinB2通過調(diào)控NMDA 受體的功能而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而胞外信號激酶ERK1／2通過調(diào)節(jié)ephrinB2的作用參與腦卒中的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠50只，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重180g～250g。遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令（第55號）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則，遵循山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。

1.2 模型的制備 采用改良的四血管夾閉法進(jìn)行15min短暫前腦缺血，實(shí)驗(yàn)中保持大鼠體溫37.0℃，缺血后出現(xiàn)驚厥的動(dòng)物予以排除。再灌注6h、24h或48h后，斷頭取腦。

1.3 Caspase－3 活性檢測 新鮮或凍存的海馬組織標(biāo)本，按1 mg組織加入10μL裂解液的比例進(jìn)行裂解，置冰上以小型玻璃勻漿器勻漿。于4℃，14 000g離心20min，取上清，用ELISA法測定腦組織裂解物中Caspase－3的活性。蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化校正：（測定孔OD 值－空白孔OD 值）／蛋白含量；以正常組（偽手術(shù)組）的活性為1，計(jì)算其余各組的相對活性：實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)化矯正后OD 值／正常組標(biāo)準(zhǔn)化矯正后OD 值。

1.4 Western－Blot檢測 用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠變性電泳（SDS－PAGE）及轉(zhuǎn)膜后，以β－actin為內(nèi)參，進(jìn)行各個(gè)特異性抗體孵育。經(jīng)KODAK IS440自顯影系統(tǒng)曝光顯影，使用KODAK MI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0 分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05，P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Caspase－3 酶 活 性 的 檢 測 提 前 給 予U0126 后 可 以 使Caspase－3酶活性明顯降低，缺血再灌注24h組由2.35±0.25下降到1.25±0.13，48h組由1.50±0.10下降到0.86±0.09，（P＜0.05）。

2.2 缺血再灌注后6h、24h、48h各蛋白磷酸化水平的變化與正常對照組相比，提前側(cè)腦室注射p－ERK1／2特異性抑制劑U0126后，p－ERK1／2 的磷酸化水平與實(shí)驗(yàn)一相比出現(xiàn)一種大幅 下降的趨勢，再灌后6h由（4.07±0.04）下降到（1.39±0.02），24h由（7.59±0.03）下降到（2.31±0.06）、48h由（6.61±0.06）下降到（1.58±0.02），出現(xiàn)了明顯的磷酸化抑制作用。同時(shí)，海馬缺血再灌注后海馬CA1 區(qū)組織中EphrinB2的表達(dá)水平升高，在6h時(shí)表達(dá)增高，給予U0126 能夠降低EphrinB2的表達(dá)。再灌注24h后表達(dá)從（3.56±0.02）下降到（2.20±0.11），在48h組，表達(dá)從（3.05±0.01）下降到（1.47±0.22，P＜0.05）。提前給予U0126抑制了缺血再灌注引起的NMDA 受體的活化，表現(xiàn)為受體亞基活化水平的下降。其中，作為NMDA受體的功能性亞基NR1的磷酸化水平出現(xiàn)了大幅下降，分別由24h的（7.91±0.79）下降到（2.30±0.70），48h的（5.40±0.82）下降到（2.90±0.12），NR2A亞基的磷酸化水平由24h的（3.17±0.32）下降到（2.57±0.04），48h由（6.22±0.76）下降到（1.90±0.18），NR2B亞基的磷酸化水平變化與實(shí)驗(yàn)一相比變化不大（P＜0.05）

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注后6h時(shí)ephrinB2的表達(dá)水平即有快速而顯著的升高，并且在24h達(dá)到表達(dá)的高峰，48h其表達(dá)水平略微下降，這可能與神經(jīng)元在48h已經(jīng)大量死亡有關(guān)。ephrinB2參與了腦缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷，并且可能在其中發(fā)揮重要的作用。ephrinB2可能通過對NMDA 受體功能的調(diào)控來參與腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元的損傷。在四血管夾閉的全腦短暫缺血再灌注模型中，隨著ephrinB2表達(dá)的快速增高，NMDA 受體的各個(gè)活化性亞基也呈現(xiàn)出磷酸化水平的快速增高，包括p－NR1、p－NR2A、p－NR2B，其中p－NR2A 隨著再灌注時(shí)間持續(xù)升高，其他亞基的活化水平均呈現(xiàn)在24h達(dá)到表達(dá)高峰，在48h開始下降，這可能與神經(jīng)元在48h已經(jīng)大量死亡有關(guān)。這與以往報(bào)道ephrinB2在MEK 過表達(dá)的癲癇模型中通過調(diào)節(jié)NMDA 受體活化來參與癲癇發(fā)生的病理過程相一致，但也僅僅是對NR2B的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，在成年大鼠腦缺血再灌注損傷的模型中，ephrinB2對NMDA 受體NR1、NR2A、NR2B亞基均具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響神經(jīng)元的存活。

本研究顯示，在缺血再灌注后p－ERK1／2的水平出現(xiàn)快速的增高，在24h達(dá)到了表達(dá)高峰，48h開始有略微下降，比結(jié)果與Noshita于2002年的研究結(jié)果相一致，阻止ERK 的磷酸化可以使腦缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡情況得到緩解［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，p－ERK1／2表達(dá)水平的變化與ephrinB2的表達(dá)水平具有高度的相關(guān)性。在大鼠前腦短暫缺血再灌注的發(fā)生過程中，p－ERK1／2通過調(diào)節(jié)ephrinB2來調(diào)控缺血再灌注后海馬錐體神經(jīng)元的死亡。在缺血再灌注之前給予ERK1／2的特異性抑制劑U0126后發(fā)現(xiàn)，隨著ERK1／2的活化被特異性的抑制，ephrinB2的表達(dá)水平呈現(xiàn)了大幅下降趨勢。ERK1／2 可能通過與ephrinB2的相互作用來參與到缺血再灌注后海馬神經(jīng)元的損傷過程，并且ephrinB2的表達(dá)受到了ERK1／2的活化調(diào)控。提前給予ERK1／2的特異性抑制劑后，可以降低缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷程度。

本研究首次在前腦缺血再灌注后引起的神經(jīng)元損傷中研究了p－ERK1／2、ephrinB2、NMDA 受體的相互關(guān)系。研究提示受p－ERK1／2調(diào)控的ephrinB2在缺血再灌注后CA1 區(qū)神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮著重要的作用。

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