常洪波 高 銘 王淑為 趙思源 盧旺盛 于 新 田增民 張劍寧

32P膠體體外誘導(dǎo)顱咽管瘤細(xì)胞凋亡*

常洪波①高 銘②王淑為①趙思源①盧旺盛①于 新①田增民①張劍寧①

目的：探討32P膠體對顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）體外培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。方法：通過原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得CP有限傳代細(xì)胞系，經(jīng)不同濃度32P膠體處理不同時間后，應(yīng)用MTT比色法繪制細(xì)胞存活率曲線。流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞凋亡率。Hoechst 33342熒光染色檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)。TUNEL熒光染色檢測DNA特征改變。透射電子顯微鏡（TEM）檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：Hoechst 33342熒光染色、TUNEL熒光染色、TEM均證實32P膠體確能引起CP細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。隨著32P膠體處理濃度（0～14.80 MBq/mL）及時間（1～14 d）的增加，CP細(xì)胞存活率減少、凋亡率增高。結(jié)論：32P膠體能明顯抑制CP體外培養(yǎng)細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡，劑量越大及處理時間越長其殺傷作用越強(qiáng)。

顱咽管瘤 細(xì)胞培養(yǎng) 凋亡 磷-32

顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）經(jīng)初次開顱手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率為9%～51%，平均時間26～96個月，再次開顱手術(shù)患者往往難以耐受［1-2］。本科自1985年應(yīng)用立體定向32P膠體內(nèi)放療治療囊性CP，成功治療患者1 200余例［3］。32P膠體是否引起CP細(xì)胞發(fā)生快速凋亡和（或）遲發(fā)性凋亡，或引起CP組織營養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞或周圍成纖維細(xì)胞的凋亡、壞死，使CP細(xì)胞失營養(yǎng)而發(fā)揮治療作用尚不得知。32P膠體是否在低劑量輻射條件下利用凋亡途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，而高劑量輻射直接引起細(xì)胞壞死，既往鮮見相關(guān)報道。驗證32P膠體導(dǎo)致的凋亡機(jī)制、劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系對治療劑量選擇和治療方案優(yōu)化等有重要意義。因此，本研究建立了CP的有限傳代細(xì)胞株，用32P膠體處理CP體外培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡變化，探討其可能的機(jī)理，建立劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

32P膠體即磷酸鉻（32P-chromic phosphate，32P-CP）膠體注射劑，由中國原子高科股份有限公司生產(chǎn)。表皮生長因子、1 mg/mL膠原酶、0.25%胰蛋白酶/0.05%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及高糖改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自美國Gibco公司；MTT、Hoechst 33342熒光試劑盒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（annexin V-fluorescein iso-thiocyanate，Annexin-V-FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、青霉素均為美國Sigma公司產(chǎn)品。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase［TdT］-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒為美國Vazyme公司產(chǎn)品。廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）及鼠二步法免疫組織化學(xué)試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CP細(xì)胞原代培養(yǎng) 新鮮CP手術(shù)切除組織塊來源于本科手術(shù)患者，術(shù)后病理證實為牙釉質(zhì)型。采用顯微鏡下組織修剪、胰酶差速貼壁消化法結(jié)合機(jī)械刮除法建立CP有限傳代細(xì)胞系。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況及細(xì)胞形態(tài)，Pan-CK（1：500）免疫組織化學(xué)染色鑒定。將傳代第2代呈對數(shù)生長期細(xì)胞用不同初始放射性活度的32P膠體進(jìn)行不同照射時間處理后行后續(xù)檢測。

1.2.2 實驗方法與分組 取對數(shù)生長期的CP細(xì)胞，接種2×106個/孔單細(xì)胞懸液于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h并貼壁后分為對照組與處理組。處理組分別加入使用生理鹽水稀釋的100 μL初始放射性活度為1.85、3.70、7.40、14.80、29.60 MBq的32P膠體，每孔加藥后用培養(yǎng)液調(diào)整總體積為2 mL，5組初始放射性濃度分別為0.925、1.850、3.700、7.400、14.800 MBq/mL；陰性對照組則加入100 μL的冷膠體，空白對照組為100 μL的生理鹽水。分別于處理1、3、5、9、14 d后進(jìn)行樣本檢測，各組每孔均設(shè)5個復(fù)孔取其均值。

1.2.3 MTT比色法檢測細(xì)胞存活情況 各組細(xì)胞處理后用細(xì)胞酶標(biāo)儀在490 nm測定各孔吸光度值（optical density，OD），取各孔吸光度的平均值。存活率分析為當(dāng)前存活率=同一濃度處理組OD值均值/陰性對照組OD值均值×100%，設(shè)陰性對照組存活率為100%。以濃度為橫軸、細(xì)胞存活率為縱軸繪制不同天數(shù)的細(xì)胞存活率曲線。

1.2.4 FCM檢測凋亡率 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細(xì)胞及陰性對照組CP細(xì)胞1×105個/mL各取2 mL，4℃離心，1 500 r/min×10 min，棄上清，重復(fù)PBS洗滌操作1次，細(xì)胞重懸后分別加入10 μL Annexin-V-FITC及5 μL PI，反應(yīng)后立即行FCM檢測，同時對陰性對照組進(jìn)行檢測。FCM激發(fā)光波長用488 nm，波長515 nm檢測FITC熒光，波長560 nm檢測PI熒光，數(shù)據(jù)用MultiCycle分析軟件處理，計算兩組凋亡率并進(jìn)行比較。

1.2.5 凋亡細(xì)胞的Hoechst 33342熒光檢測 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細(xì)胞爬片及陰性對照組細(xì)胞爬片加入少量Hoechst 33342染色液，覆蓋住樣品即可，室溫放置3～5 min，吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗滌2～3次，3～5 min/次。直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6TUNEL熒光染色觀察 收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細(xì)胞爬片及陰性對照組細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30～60 min，加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后使用激發(fā)波長為450～500 nm，發(fā)射波長為515～565 nm，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 TEM檢測凋亡亞細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 消化收集濃度為3.700 MBq/mL的32P膠體處理3 d后CP細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)1×105～1×107個，1 500 r/min離心15 min，4%甲醛固定后按常規(guī)程序處理行TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，凋亡率的比較用χ2檢驗，計量資料結(jié)果用±s表示，組間比較用方差分析，處理組與陰性對照組比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率曲線結(jié)果

原代培養(yǎng)CP細(xì)胞生長良好，最長可傳代6代，生存45 d，Pan-CK免疫組織化學(xué)染色鑒定為陽性結(jié)果符合CP細(xì)胞特征（圖1），成功建立了CP有限傳代細(xì)胞系。光鏡下觀察CP細(xì)胞為不規(guī)則形，連接成片，呈鋪路石狀，可見核分裂期細(xì)胞，核結(jié)構(gòu)完整，胞漿透明，無明顯顆粒，空泡樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)32P膠體處理后細(xì)胞隨著濃度及時間的增加，可見細(xì)胞增殖逐漸減緩，出現(xiàn)固縮死亡情況。將傳代第2代呈對數(shù)生長期細(xì)胞用不同初始放射性活度的32P膠體進(jìn)行照射不同時間處理后，MTT比色法檢測繪制細(xì)胞存活率曲線，可見隨著處理濃度的增加細(xì)胞存活率明顯降低；隨著處理時間的延長細(xì)胞存活率明顯降低（圖2）。不同濃度32P膠體處理1、3、5、9、14 d組OD值方差分析結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；處理組分別與陰性對照組比較，除處理1 d的0.925 MBq/mL處理組與0 MBq/mL陰性對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）以外，其他各組與0 MBq/mL陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 FCM檢測凋亡率比較結(jié)果

3.700 MBq/mL作用3 d處理組凋亡率為38.1%，陰性對照組凋亡率為5.5%（均包括早期及晚期凋亡），經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.3 Hoechst 33342熒光染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果

處理組細(xì)胞核藍(lán)色深染，形態(tài)不規(guī)則，體積變小，染色質(zhì)濃縮、碎裂、邊緣化，可見特征性凋亡小體（圖4A）。陰性對照組CP細(xì)胞核大小較一致，染色質(zhì)藍(lán)色熒光分布較均勻，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整（圖4B）。

表1 32P膠體處理CP細(xì)胞不同時期各組OD值±s，n=5Table 1 Optical density of CP cells in each group treated with32P colloid for different times（±s，n=5）

Time（d）Concentration（MBq/mL）1 3 5 9 1 4 0 0.31±0.05 0.43±0.05 0.60±0.02 0.77±0.02 1.00±0.02 0.925 0.29±0.05 0.38±0.05a0.51±0.02a0.60±0.05a0.73±0.02a1.850 0.26±0.01a0.34±0.01a0.44±0.03a0.53±0.05a0.60±0.05a3.700 0.21±0.02a0.26±0.01a0.32±0.02a0.36±0.04a0.32±0.03a7.400 0.18±0.02a0.21±0.01a0.25±0.02a0.27±0.05a0.26±0.02a14.800 0.15±0.01a0.18±0.01a0.19±0.01a0.22±0.01a0.21±0.02aaP＜0.05 vs 0MBq/mL，with statistical significance

2.4 TUNEL熒光染色觀察結(jié)果

處理組CP細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光特征的陽性表現(xiàn)，表明經(jīng)處理后發(fā)生了凋亡改變（圖4C）。對照組僅見少量綠色熒光顯色，無凋亡發(fā)生（圖4D）。

2.5 TEM檢測亞細(xì)胞凋亡形態(tài)結(jié)果

處理組CP細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、核密度增高，細(xì)胞變小并核碎裂，胞漿中出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)；可見凋亡細(xì)胞經(jīng)核碎裂后形成的染色質(zhì)塊（核碎片），且細(xì)胞有發(fā)芽、起泡，處于脫落成球形內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片的凋亡膜包小體早期改變（圖5A）。正常CP細(xì)胞呈多角形，核內(nèi)染色質(zhì)分布較均勻，核膜清晰；胞漿豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體清晰；細(xì)胞膜不規(guī)則，有凸起（圖5B）。

3 討論

目前國內(nèi)外對CP的基礎(chǔ)研究仍少，本實驗為首次應(yīng)用32P膠體處理CP體外培養(yǎng)細(xì)胞后檢測其誘導(dǎo)凋亡作用及劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系。研究的前提是建立CP細(xì)胞可長期穩(wěn)定傳代存活的有限傳代細(xì)胞系，國內(nèi)外已有學(xué)者成功建立了CP有限傳代細(xì)胞系［4-6］。本研究通過對新鮮切除的腫瘤組織標(biāo)本采用顯微鏡下修剪、胰酶差速貼壁消化法結(jié)合機(jī)械刮除法實現(xiàn)了對CP細(xì)胞的分離純化及有限地連續(xù)傳代培養(yǎng)，并經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色鑒定腫瘤細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)。CP細(xì)胞的倍增時間為3～5 d，細(xì)胞對數(shù)期生長可維持2～3 w，成功傳代第2代及第3代的細(xì)胞株生長較穩(wěn)定，可進(jìn)行凍存和復(fù)蘇處理，為本實驗使用的穩(wěn)定細(xì)胞株。本實驗培養(yǎng)的CP細(xì)胞經(jīng)病理證實為釉質(zhì)上皮型，其穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)成功率高。

適合CP囊內(nèi)治療的藥物主要分為化學(xué)治療藥物及放射治療藥物。國內(nèi)外有報道用維甲酸、博萊霉素、干擾素α（interferon alpha，IFNα）等化學(xué)藥物臨床應(yīng)用或?qū)嶒炋幚眢w外培養(yǎng)的CP細(xì)胞觀察療效，但均具有敏感性不強(qiáng)及毒副反應(yīng)大等缺點(diǎn)，目前臨床應(yīng)用不多［7-9］。Cáceres等［9］總結(jié)了既往博萊霉素應(yīng)用于囊性CP治療情況后認(rèn)為其抑制囊液分泌效果好，但也有部分病例產(chǎn)生了神經(jīng)毒性反應(yīng)情況。因其半衰期較短，往往需要短時間多次用藥控制囊性復(fù)發(fā)，且其本身滲漏后對神經(jīng)系統(tǒng)毒副反應(yīng)較大，近幾年相關(guān)報道較少。Kickingereder等［10］總結(jié)了博萊霉素與IFNα的作用后認(rèn)為其不如β射線核素藥物更安全有效，并推薦應(yīng)用32P膠體。Cavalheiro等［11］應(yīng)用IFNα治療CP結(jié)果提示，60例患者的多中心研究報道平均隨訪44個月，腫瘤控制率為78%，僅有少量相關(guān)的不良反應(yīng)：頭痛（10%）、水腫（8%）、發(fā)熱（8%）以及容易疲勞（2%）。相對于博萊霉素和32P膠體，IFNα無相關(guān)神經(jīng)毒性副作用及明顯禁忌證，但到目前為止，IFNα的研究經(jīng)驗有限［12］。Blackburn等［13］認(rèn)為理想的放射治療藥物應(yīng)具有產(chǎn)生純β射線、作用范圍局限、半衰期短等特點(diǎn)，可使用磷-32（32P）、釔-90（90Y）、錸-186（186Rh）、金-198（198Au）。Trippel等［14］總結(jié)了多種放射治療藥物的應(yīng)用情況，比較了32P和90Y的特點(diǎn)。目前國內(nèi)外主要以應(yīng)用32P膠體內(nèi)放療為主。本實驗選用的32P-CP膠體為無菌、綠色溶液，核純度＞99.9%，pH為7.0，化學(xué)濃度為2.32 mg/mL，放射性濃度≥1 850 MBq/mL。32P是純β衰變核素，β射線的最大能量為1.711 MeV，半衰期為14.3 d，輻射距離8～12 mm，因其臨床安全性及效果肯定而廣泛應(yīng)用。細(xì)胞在射線作用下產(chǎn)生增殖抑制、細(xì)胞凋亡，與射線的劑量水平和物理特性之間存在一定的相關(guān)性。有報道［15］在一定劑量率條件下對實驗動物和體外培養(yǎng)細(xì)胞實施低劑量水平的照射可以誘導(dǎo)動物和細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)及興奮效應(yīng)，早期表現(xiàn)為細(xì)胞增殖明顯活躍。其分子機(jī)理可能是DNA的損傷與修復(fù)同時發(fā)生，當(dāng)用低劑量照射時其水平顯著提高，從而發(fā)生細(xì)胞短暫興奮性現(xiàn)象（1～3 d），之后才發(fā)生遲發(fā)相凋亡。這與本實驗MTT法測到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果符合。本研究采用的劑量率范圍基本涵蓋了臨床32P膠體治療的劑量范圍，但由于實驗條件及觀察時間限制，對細(xì)胞的遠(yuǎn)期殺傷效果及細(xì)胞壞死遠(yuǎn)期損傷程度觀察不夠。此外未進(jìn)行單劑量照射與多次劑量照射的實驗比較。

凋亡作為一種可調(diào)控的細(xì)胞死亡方式在腫瘤放射治療中的作用日益受到重視。惡性程度較高的細(xì)胞其凋亡發(fā)生在幾個小時之內(nèi)，表現(xiàn)為快速凋亡，而對CP等增殖較慢的細(xì)胞，通常為幾天之內(nèi)發(fā)生的遲發(fā)性凋亡。雖然用凋亡判斷輻射效應(yīng)的價值仍有爭議，但本實驗證實32P膠體確可引起CP細(xì)胞出現(xiàn)較高的凋亡率并明顯抑制其增殖，最終引起細(xì)胞的死亡。目前臨床上常用多次照射方案，主要因患者CP囊性復(fù)發(fā)后再次引起壓迫癥狀，需要再次抽吸囊液減壓并行內(nèi)放療抑制腫瘤增殖。但是多次照射最佳間隔時間很難確定。臨床上多因CP復(fù)發(fā)后再次引起癥狀時才行二次內(nèi)放療手術(shù)，一般間隔3個月以上。首次照射后最敏感細(xì)胞先被殺傷，隨后出現(xiàn)短期細(xì)胞修復(fù)的放射抗性階段，隨著時間的延長，細(xì)胞周期再分布，重新恢復(fù)了放射的敏感性，并且初次照射后也影響細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)導(dǎo)致再次照射后細(xì)胞修復(fù)能力減弱，可認(rèn)為多次照射效果更好。本實驗表明隨著照射劑量的增加及時間的延長，細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強(qiáng)。據(jù)此，臨床上本研究推薦在保證手術(shù)及照射相對安全的情況下，早期給予間斷、足量內(nèi)放療對于CP細(xì)胞殺傷效果更好，同時考慮到有發(fā)生延遲性凋亡的可能性，在無癥狀和體征等明確復(fù)發(fā)的情況下不建議貿(mào)然進(jìn)行二次內(nèi)放療手術(shù)。雖然CP的臨床治療方法較多，但爭議較大，公認(rèn)以手術(shù)全切為主。除了開顱手術(shù)之外，對于手術(shù)殘余及復(fù)發(fā)的實性腫瘤可以補(bǔ)充放射治療。隨著近年對32P膠體囊內(nèi)放療治療CP的臨床開展及基礎(chǔ)研究的深入，其不失為一種較好的控制囊性復(fù)發(fā)性CP的方法。目前CP的發(fā)生、病因、病理及細(xì)胞生物學(xué)仍不十分明確，加強(qiáng)其細(xì)胞、分子水平的研究，找尋影響預(yù)后的因素，改進(jìn)臨床治療措施勢在必行［16］。穩(wěn)定的CP腫瘤胞系和動物模型的建立已經(jīng)為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。對于隸屬良性腫瘤，卻呈惡性表現(xiàn)的CP來說，若獲得良好治療效果尚需要廣大研究學(xué)者的齊心耕耘。

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（2014-02-10收稿）

（2014-04-10修回）

（本文編輯：邢穎）

32Pcolloid induced apoptosis of craniopharyngioma cells in vitro

Hongbo CHANG1,Ming GAO2,Shuwei WANG1,Siyuan ZHAO1,Wangsheng LU1,Xin YU1,Zengmin TIAN1,Jianning ZHANG1
Correspondence to:Jianning ZHANG;E-mail:jnzhang2005@163.com

1Institute of Neurosurgery,Navy General Hospital,Navy Clinical Medical School of the Second Military Medical University,Bei

jing 100048,China;2Bayi Children's HospitalAffiliated to General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

Objective:This study aimed to investigate the possible mechanism of32P colloid induced apoptosis of craniopharyngioma(CP)cells in vitro and the relationship between dose effect and time effect.Methods:This study established a primary cell culture of CP limited subculture cell line.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to plot the cell survival curve after the CP cells were treated with32P colloid at different concentrations and time.Apoptotic rate was detected by flow cytometry(FCM).Apoptosis related DNA was investigated by TUNEL fluorescent staining.The morphological characteristics of apoptotic cells were determined by Hoechst33342 fluorescence staining.The ultrastructure of apoptotic cells was investigated by transmission electron microscopy(TEM).Results:Hoechst33342 fluorescence staining,TUNEL fluorescence staining,and TEM revealed that32P colloid induced the apoptosis of CP cells.32P colloid reduced the survival rate and increased the apoptotic rate of CP cells as concentration(0 MBq/mL to 14.80 MBq/ mL)and time(1 d to 14 d)were increased.Conclusion:32P colloid could effectively inhibit the growth of CP cells and induce apoptosis in vitro.High concentrations and prolonged time could induce a remarkable effect.

craniopharyngioma,cell culture,apoptosis,phosphorus-32

10.3969/j.issn.1000-8179.20140197

常洪波 醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。研究方向為顱咽管瘤及膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

①第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科研究所（北京市100048）；②北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院

*本文課題受首都醫(yī)學(xué)發(fā)展科研基金（編號：2009-2053）資助

張劍寧 jnzhang2005@163.com

E-mail：changhongbo2000@gmail.com