張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測結(jié)果的影響因素和應(yīng)對措施

張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；影響因素；應(yīng)對措施

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是血站檢驗(yàn)獻(xiàn)血者血液是否符合既定標(biāo)準(zhǔn)的常用檢測方法，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面進(jìn)行酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)，用洗滌法洗除液相中的游離成分。因其具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、達(dá)納克水平和經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)勢，廣泛為臨床實(shí)踐所應(yīng)用。但在檢驗(yàn)實(shí)際操作過程中，在各種主客觀因素的影響下，可影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，筆者總結(jié)分析ELISA試驗(yàn)操作各個(gè)環(huán)節(jié)中容易出現(xiàn)的問題和注意事項(xiàng)，以不斷提高檢驗(yàn)質(zhì)量，滿足各種需求。

1 試劑的準(zhǔn)備

目前各種ELISA試驗(yàn)均有商品化的專用試劑盒。應(yīng)選擇質(zhì)量優(yōu)良、有批準(zhǔn)文號的檢測試劑，試劑必須在有效期內(nèi)使用，實(shí)際操作時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行試劑說明書。試劑從冰箱取出后，應(yīng)放在室溫或37 ℃條件下30 min再進(jìn)行檢測。保存試劑盒的冰箱應(yīng)經(jīng)常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應(yīng)避免頻繁開關(guān)。試劑使用前應(yīng)搖勻。

2 標(biāo)本的采集和保存

血站ELISA試驗(yàn)所用標(biāo)本均為血清，臨床上使用的標(biāo)本還包括經(jīng)過預(yù)處理的唾液、尿液、糞便等生物材料。

對于含有免疫物質(zhì)的標(biāo)本，可干擾試驗(yàn)，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。干擾因素包括兩類，其中內(nèi)源性因素包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，主要通過試劑的合理選擇予以有效避免。外源性因素包括標(biāo)本溶血和凝固、被細(xì)菌污染、儲存時(shí)間過長等，實(shí)際工作中應(yīng)采取避免溶血[1]和污染的措施。否則，紅細(xì)胞溶解時(shí)會釋放具有過氧化物酶活性的亞鐵血紅素的血紅蛋白；應(yīng)避免污染標(biāo)本，一旦污染菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，當(dāng)以HRP為標(biāo)記時(shí)，可增加非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。應(yīng)保持檢測標(biāo)本處于新鮮狀態(tài)，需低溫保存推遲檢測標(biāo)本，分別在2～8 ℃和低溫條件下保存7 d內(nèi)和7 d后檢測的血清標(biāo)本。同時(shí)，反復(fù)冰融會使抗體效價(jià)降低，需多次測定抗體的血清標(biāo)本應(yīng)采用少量分裝并冰存的保存方法。應(yīng)充分離心血清標(biāo)本，否則可因纖維蛋白原的殘留使其在微孔吸附而致假陽性結(jié)果。

所以，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)按要求認(rèn)真查對血清標(biāo)本，拒收不符合要求的標(biāo)本和申請單，為避免溶血要及時(shí)分離合格標(biāo)本的血清，并保證其中不得混有大量纖維蛋白或細(xì)胞成分，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。不能及時(shí)檢測的標(biāo)本要按要求保存并作好記錄，標(biāo)本從冰箱取出后要按常規(guī)處理用于檢測。

3 加樣、育溫、洗滌、顯色和比色

3.1 加樣：在試驗(yàn)操作中，加標(biāo)本、加酶結(jié)合物和加底物為循序漸進(jìn)的加樣流程。前者一般采用手工或者微量加樣器的方法加樣。但應(yīng)注意：①每次手工加樣前必須更換吸嘴以避免交叉感染；②為保證準(zhǔn)確加樣，應(yīng)揣摩并熟練掌握加樣技巧；③必須定期維護(hù)和校準(zhǔn)加樣器，因?yàn)槭褂脮r(shí)間過長，因機(jī)械磨損或推動桿內(nèi)血痂附著等原因造成加樣不準(zhǔn)。加酶結(jié)合物和底物可直接滴加，一般不用微量加樣器。每次加樣時(shí)，為避免加在孔壁上部，應(yīng)置所加物于ELISA板孔的底部，不得出現(xiàn)濺出、產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象，加酶試劑后要用吸水紙輕輕擦拭吸干酶標(biāo)板。加底物操作時(shí)，不得混用各試劑盒顯色劑，不得顛倒添加順序，不得濺出孔外。較多標(biāo)本時(shí)，為避免因加樣板過多所致加樣后等待時(shí)間過長放入孵箱，尤其在較高室溫條件下操作要分批進(jìn)行。最后為保證混勻，在微型振蕩器上震蕩1 min。

3.2 溫育：酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)是在固相表面發(fā)生的一系列反應(yīng)，只有經(jīng)過擴(kuò)散后抗原抗體結(jié)合才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)，可見溫育需要一定時(shí)間，也是檢測結(jié)果的關(guān)鍵影響因素之一，最為明顯的是弱陽性標(biāo)本[2]。水浴法、微波輻射法和溫箱法為最常用的溫育方式，第一種方法能較好地解決周圍孔與中央孔因受熱不均衡所致吸光度誤差。37 ℃適合大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)是最常用的溫度，另外尚可采用是4 ℃、室溫和43 ℃。為了迅速平衡各板溫度，可使反應(yīng)板漂浮在水浴箱水面上，但不得疊放；反應(yīng)板應(yīng)加蓋或貼封紙，目的在于防止標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)在孔壁上吸附。應(yīng)準(zhǔn)確掌握溫育的溫度和時(shí)間，因?yàn)闇囟炔粶?zhǔn)影響反應(yīng)過程，時(shí)間過長可在反應(yīng)孔周圍出現(xiàn)非特異性結(jié)合導(dǎo)致花板，這難以徹底洗滌。

3.3 洗滌：影響ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素之一是洗滌。操作者應(yīng)嚴(yán)格按照要求洗滌，將游離酶標(biāo)志物和結(jié)合酶標(biāo)志物分離開來，可以將殘留在板孔中沒有參與反應(yīng)的物質(zhì)和反應(yīng)過程中吸附于固相載體的干擾物質(zhì)予以清除。要按要求設(shè)置自動洗板機(jī)洗板的時(shí)間、間隔、次數(shù)，次數(shù)較少可造成殘留出現(xiàn)假陽性結(jié)果，次數(shù)過多可洗脫抗原抗體結(jié)合物出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應(yīng)孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結(jié)束后，應(yīng)在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足，影響洗板效果，可堵塞洗板針，不完全抽吸，洗板不暢，不能徹底洗板。

3.4 顯色：顯色是酶催化底物由無色到有色的過程，影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素為反應(yīng)的溫度和時(shí)間。在一定時(shí)間內(nèi)，溫度適當(dāng)提高，陰性孔可保持無色，隨時(shí)間延長陽性孔則呈色加強(qiáng)。在定量檢測中，力求準(zhǔn)確掌握底物加入后的反應(yīng)溫度和時(shí)間。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高臨界值樣本的分析準(zhǔn)確度，因肉眼直接判斷結(jié)果存在個(gè)體差異應(yīng)盡量避免，最好通過酶標(biāo)儀觀察測定顯色結(jié)果。應(yīng)注意，加顯色劑時(shí)，要保持顯色劑不外流。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生較多氣泡，否則可能使假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率增加。

3.5 比色：目視法簡單明了，但對同一標(biāo)本結(jié)果判定有一定的個(gè)體差異，甚或截然不同的結(jié)果。比色的結(jié)果通常用光密度表達(dá)，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度表達(dá)。但不應(yīng)在陽光或強(qiáng)光照射下安置酶標(biāo)儀，應(yīng)在15～30℃室溫條件下進(jìn)行操作，使用前要先預(yù)熱15～30 min儀器，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。比色前，應(yīng)將板底附著的液體用潔凈的吸水紙擦拭干凈，然后將其放在酶標(biāo)儀的比色架上。

4 固相載體和抗原

4.1 固相載體：進(jìn)行酶標(biāo)記測定的基本條件是吸附于固相載體中的可溶性抗原或抗體變?yōu)椴蝗苄问剑郾揭蚁┗蚓勐纫蚁┪⒘糠磻?yīng)板及塑料管為常用固相載體。微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。因此，在使用每批制品前，必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室鑒定合格后方可使用。鑒定的方法：按規(guī)定隨機(jī)抽取每批固相載體，包被用0.2 μg/mL純化正常人IgG，洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)比色計(jì)中逐孔測定其消光值和光密度值。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：一般認(rèn)為，全板中每兩孔間光密度值誤差在10%以下為合格；如果中間孔光密度值與四周孔相差較大，或者反應(yīng)板的一邊光密度值與另一邊凹孔相差較大，均不合格；檢查陽性和陰性參考血清光密度值的差異在10倍左右為合格。微量反應(yīng)板或塑料管在使用前用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用，不一定經(jīng)過特殊處理。

4.2 抗原：抗原或抗體包被于固相載體表面，其來源和制備方法可影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性?？乖蟊仨毧扇?、優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定，具有高純度和高免疫原性。當(dāng)抗原純度不高時(shí)，其中的雜質(zhì)會競爭固相載體上的有限位置，使其敏感性和特異性下降；制備包被抗原時(shí)，其免疫學(xué)活性不應(yīng)受到破壞。一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的可溶性抗原均可用于ELISA，在作ELISA時(shí)，必須要有1～2種試劑、要求純化，但在包被用表面活性劑提取的抗原前必須將表面活性劑透析除去，否則難以吸附到固相載體上。包被固相載體時(shí)要用濃度適當(dāng)?shù)目乖蚩贵w蛋白，如濃度太高則抗體效價(jià)低，可能測不出來；過量包被形成多層抗原吸附，可能造成脫落，檢測結(jié)果的敏感性和可重復(fù)性得以降低。

5 實(shí)驗(yàn)人員素質(zhì)因素

人員素質(zhì)是影響檢驗(yàn)結(jié)果的首要因素。思想素質(zhì)、業(yè)務(wù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體素質(zhì)組成實(shí)驗(yàn)室人員的主要素質(zhì)。首先，實(shí)驗(yàn)人員的思想素質(zhì)應(yīng)良好，因?yàn)槠浞?wù)對象包括獻(xiàn)血者和受血者，其道德水平直接關(guān)系到人們的健康和生命安危。所以，必須應(yīng)該熱愛專業(yè)，耐心細(xì)致，一旦出現(xiàn)如標(biāo)本混淆、報(bào)告單記錄錯(cuò)誤等現(xiàn)象，可能危害受血者的身心健康；其次，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)有高超的業(yè)務(wù)素質(zhì)。要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本操作技能，認(rèn)真學(xué)習(xí)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)前瞻性知識，不斷提高自己的業(yè)務(wù)能力和水平，適應(yīng)崗位需求。心理素質(zhì)要求檢驗(yàn)人員應(yīng)勇于面對工作生活中的挫折和壓力，有條不紊，冷靜沉著地開展各項(xiàng)檢驗(yàn)工作。

綜上所述，保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件是具有優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作。在實(shí)際應(yīng)用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，嚴(yán)格仔細(xì)的核查每個(gè)環(huán)節(jié)，盡量避免假陽性和假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，保證檢測結(jié)果真實(shí)可靠。

[1] 孫鑫,陳彥,張繼瑜,等.不同程度溶血對ELISA法檢測血清HBVM的影響[J].世界感染雜志,2004,4(2):174-176.

[2] 徐錫霞,鄧巍.溫育條件對ELISA定性測定HBsAg結(jié)果的影響[J].實(shí)用肝病雜志,2005,8(1):16-18.

[3] 劉祖勇.增加洗板次數(shù)對HBsAg ELISA檢測影響[J].中國輸血雜志,2006,19(2):135-136.

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