劉昱言 劉 軻 劉敬霞 李建生

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管疾病(ICVD)約占全部腦血管意外的60%～80%〔1〕。大多數(shù)的ICVD是由動(dòng)脈血管內(nèi)血栓阻塞血管所致，理想的治療方法是早期再通閉塞的血管。溶栓治療可在有效的時(shí)間窗內(nèi)溶解血栓，恢復(fù)血流，挽救缺血半暗帶的部分損傷腦組織，是急性腦梗死治療中挽救缺血腦組織的最佳方案〔2〕。但溶栓后血流再通及再灌注損傷可引起腦微血管基底膜模糊、斷裂、水腫,出現(xiàn)節(jié)段性溶解、脫落、缺損,微血管結(jié)構(gòu)完整性受損,這不僅加重缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷；而且使血腦屏障(BBB)通透性增高,引起毛細(xì)血管內(nèi)水分和血漿蛋白外滲,導(dǎo)致血管源性腦水腫。近年來研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、-9在腦微血管損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用，此為腦缺血微血管損傷的病理生理機(jī)制及其治療提供新思路。MMP-2、-9屬于蛋白酶家族中的明膠酶系，通常降解細(xì)胞-1(TIMP-1)可特異性地對(duì)抗其增強(qiáng)，起到保護(hù)微血管受損的作用?，F(xiàn)就MMP-2、-9與腦缺血微血管損傷的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 明膠酶系

1.1分類 明膠酶系屬于MMPs家族中的成員，所謂MMPs是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的鈣離子和鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，以酶原形式存在,在細(xì)胞外激活,激活的MMPs可選擇性降解多種ECM成分,主要包括：膠原、明膠、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖等。依據(jù)其作用底物的不同可分為膠原酶(MMP-1,-8等)、明膠酶(MMP-2,-9)、間質(zhì)溶解素(MMP-3,-10，-11)、膜型MMPs(MMP-14,-15,-16,-17)和其他成員(基質(zhì)降解素、巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶)。其中，MMP-2、-9因在催化區(qū)內(nèi)含有3個(gè)重復(fù)的纖維連接蛋白-Ⅱ基因片段,共用具有相似的蛋白水解活性和降解變性的膠原、明膠、還有一些細(xì)胞外基質(zhì)分子被稱為“明膠酶系”。這些細(xì)胞外基質(zhì)分子包括天然Ⅳ，Ⅴ和Ⅺ型膠原、層黏連蛋白及聚集蛋白聚糖核心蛋白。MMP-2因相對(duì)分子質(zhì)量為 72×103(72 kD)又被稱為72 kD Ⅳ型膠原酶或明膠酶A，主要底物包括明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白及纖維連接蛋白。MMP-9的相對(duì)分子質(zhì)量為92×103(92 kD)被稱為92 kD Ⅳ型膠原酶或明膠酶B，主要底物包括明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原和彈性蛋白。MMP-2還能溶解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原。然而，MMP-2的膠原酶活性相對(duì)其他酶弱一些。由于MMP-2酶原被募集于細(xì)胞表面并由膜結(jié)合的MT-MMPs激活，它可聚集于細(xì)胞外并表達(dá)某種原生膠原酶活性，并能發(fā)揮協(xié)同作用，使膠原分解為更小的碎片，這些碎片會(huì)在37℃的體溫下變性〔3〕。

1.2MMP-2 、MMP-9在中樞神經(jīng)系的分布、表達(dá)及作用 健康人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng),可檢測(cè)到星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等都能釋放MMP-2、-9。MMP-2 mRNA、蛋白質(zhì)、酶活性廣泛存在于腦組織中,膠質(zhì)細(xì)胞中最多?；钚訫MP-2產(chǎn)生于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。MMP-9 mRNA、蛋白質(zhì)、酶活性主要存在于海馬、小腦和大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞中,MMP-9的蛋白和酶活性主要在胞體和樹突中，而且體外研究表明MMP-9蛋白可在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元表達(dá)〔4〕。

MMPs在健康中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的一種重要蛋白酶，能選擇性作用多種ECM成分，消化降解間質(zhì)內(nèi)的ECM成分，并影響基質(zhì)的重塑，通過維持ECM成分合成和降解的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷時(shí)起修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，但某些情況下，機(jī)內(nèi)的一些MMPs同時(shí)急劇升高反而會(huì)導(dǎo)致機(jī)體病理損傷。因此，MMPs有雙重功能，一方面能介導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)，另一方面又造成機(jī)體損。在正常穩(wěn)定狀態(tài)的組織中，MMPs表達(dá)量極少；而在涉及人體多種生理和病理過程中，如炎癥，新生血管形成，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移時(shí)，其表達(dá)量上升。

1.3MMP-2 、MMP-9的活性調(diào)節(jié) MMPs的生物活性受基因轉(zhuǎn)錄、酶原活化和酶抑制劑等多因素調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平包括白介素(IL)-1、IL-12、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF)-α、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。研究表明TNF-α能上調(diào)MMPs的表達(dá)；TGF-β、IFN-γ、類固醇激素(包括糖皮質(zhì)激素)和視黃醛則下調(diào)MMPs的表達(dá)〔5〕。MMPs是以無活性的酶原形式分泌的，通常認(rèn)為只有被活化后才能降解基質(zhì)蛋白，這是控制ECM降解的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明:纖溶酶原在尿激酶纖溶酶原活化劑或組織纖溶酶原活化劑(uPA或tPA)催化下變成纖溶酶，纖溶酶可部分激活間質(zhì)膠原酶和基質(zhì)分解素原〔6〕。MMP-2體內(nèi)激活途徑與其他MMPs不同，不被plasmin/uPA系統(tǒng)激活，而是通過其C末端與位于細(xì)胞膜表面的MT1-MMP相互作用而激活。金屬蛋白酶相互間也存在著激活作用，研究表明，受損血管平滑肌細(xì)胞中MMP-3增加，而MMP-3可誘導(dǎo)MMP-2，MMP-9的表達(dá)，共同參與血管壁損傷〔7〕。MMPs分子之間存在的相互級(jí)聯(lián)激活機(jī)制對(duì)于調(diào)節(jié)MMPs的潛在活性具有重要作用，同時(shí)也把MMPs與纖溶系統(tǒng)聯(lián)系在一起。TIMP調(diào)控，MMPs的蛋白水解酶活性受非特異性和特異性抑制劑的抑制，非特異性抑制劑包括a2-巨球蛋白、a1-抗蛋白酶和BB-94(batimistat)；特異性抑制劑為組織型TIMPs。目前發(fā)現(xiàn)的，TIMPs分4型，它以1∶1的比例與活化的MMPs結(jié)合，并抑制其活性。TIMP-1抑制大多數(shù)MMPs的活性，但不包括MT1-MMP和MMP-2；TIMP-2對(duì)除MMP-9外的大多數(shù)MMPs均有抑制作用；TIMP-3具有抑制MMP-1,-2,-3,-9,-13活性的作用。TIMP-4則參與穩(wěn)定ECM。TIMPs在ECM代謝中起著與MMPs對(duì)應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可阻止MMPs的活化，并抑制其作用，影響蛋白分解損傷的程度和持續(xù)時(shí)間。在一些基質(zhì)過度降解的疾病，MMPs和TIMPs之間平衡失調(diào)，導(dǎo)致MMPs活性總體上凈增加〔3〕。

2 MMP-2、MMP-9與BBB損傷

腦部微血管與體內(nèi)大多數(shù)微血管床不同，小分子的溶質(zhì)不能自由通過腦微血管，即所謂BBB。其主要結(jié)構(gòu)包括內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、EC的緊密連接(TJ)、星形細(xì)胞、周皮細(xì)胞和血管周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞以及基底膜等。當(dāng)腦組織發(fā)生病變時(shí),腦微血管是受侵害的首要靶點(diǎn),缺血可以使腦微血管結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性變化。微血管結(jié)構(gòu)的損害導(dǎo)致BBB功能破壞,加重缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷。許多著名的實(shí)驗(yàn)研究均證明永久或短暫性腦缺血后病變區(qū)MMP-2與MMP-9表達(dá)增加，同時(shí)有ECM中的片蛋白、纖維連接蛋白與Ⅳ型膠原的消失、毛細(xì)血管通透性增加，注射Evans藍(lán)可見外溢。腦缺血后缺血區(qū)MMP-2與MMP-9表達(dá)有明顯的時(shí)間差異，MMP-9表達(dá)時(shí)間比MMP-2早。缺血后3～4 h缺血區(qū)MMP-9表達(dá)開始增加,12 h明顯增高,4～5 d達(dá)到高峰，一直持續(xù)到缺血后第15天表達(dá)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。MMP-2則從缺血后24 h出現(xiàn)低水平表達(dá)，第5天開始表達(dá)增高,至30 d時(shí)仍有不明顯的低水平表達(dá)。MMP-2與MMP-9這種表達(dá)時(shí)間上的差異可能是由于MMP-9與急性期BBB損傷有關(guān),而MMP-2則與缺血后損傷的修復(fù)有關(guān)〔8〕。缺血后MMP-2和MMP-9對(duì)BBB損傷主要表現(xiàn)在為降解內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜的底物。研究表明：內(nèi)皮細(xì)胞同體內(nèi)其他細(xì)胞一樣，在生長(zhǎng)分化過程中，也產(chǎn)生豐富的ECM，其中Ⅳ型膠原是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的特異性ECM。這些基質(zhì)成分部分存在于內(nèi)皮細(xì)胞間隙，部分在內(nèi)皮細(xì)胞下形成內(nèi)皮細(xì)胞基底膜。內(nèi)皮ECM除了維持內(nèi)皮細(xì)胞正常生存、分化和運(yùn)動(dòng)外環(huán)境，還與內(nèi)皮的屏障功能有關(guān)。MMP-2和MMP-9能特異性地分解Ⅳ型膠原，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性具有直接的調(diào)控作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2，MMP-2抗體顯著抑制VEGF增加內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性作用，結(jié)果表明MMP-2活性改變以及由此導(dǎo)致的特異性基質(zhì)的分解可能與VEGF的促通透作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中未觀察到MMP-9的產(chǎn)生，表明MMP-2是內(nèi)皮細(xì)胞中惟一介導(dǎo)VEGF促通透作用的Ⅳ型膠原酶〔9〕。俞鳴〔10〕通過臨床觀察表明，急性腦梗死患者血清VEGF和MMP-9水平均明顯升高， 血清VEGF和MMP-9水平與腦梗死患者的梗死面積有一定相關(guān)性。ECM由細(xì)胞間的多種蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組成，構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境，具有支持、連接、營(yíng)養(yǎng)和防御等生理作用。ECM和基底膜的降解，在一定程度上決定著血管的完整性〔11〕。腦毛細(xì)血管壁基底膜的主要成分為Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白，局灶性腦缺血可以引起基底膜通透性和結(jié)構(gòu)的變化，造成BBB損傷。Heo等〔12〕研究表明將Wisrar大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)阻斷30 min就可出現(xiàn)MMP-9水平的升高，這一時(shí)間窗內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)水和離子從緊密連接處流出，說明MMP-9在缺血?jiǎng)傞_始時(shí)就出現(xiàn)上調(diào)，在BBB降解過程發(fā)揮作用。

3 MMP-2、MMP-9與腦缺血再灌注損傷

腦缺血后早期的血流再通有助于保護(hù)缺血半暗帶，而后期的再灌注卻加重組織損傷。腦缺血再灌注后MMPs表達(dá)增加，尤以MMP-2 和MMP-9活性增強(qiáng)最為明顯，MMPs通過降解ECM、使基底膜模糊、斷裂、水腫，出現(xiàn)節(jié)段性溶解、脫落、缺損，微血管結(jié)構(gòu)完整性受損，通透性增高,引起毛細(xì)血管內(nèi)水分和血漿蛋白外滲,導(dǎo)致細(xì)胞間隙內(nèi)水分增多，即形成血管源性腦水腫。李建生等〔13〕采用大腦中動(dòng)脈線栓法(MCAO)復(fù)制腦缺血模型，觀察神經(jīng)癥狀積分、梗死面積、病理變化、基底膜Ⅳ型膠原(ColⅣ)和層連蛋白(LN)。結(jié)果顯示腦I/R損傷與微血管基底膜ColⅣ 和LN降解有關(guān)，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。腦缺血3 h時(shí)ColⅣ 和LN變化不明顯，I/R 6 h、12 h顯著降解并逐漸加重，I/R 24 h降解達(dá)到峰值，I/R 6 d損傷趨勢(shì)有所減緩。孫曉偉等〔14〕亦采用MCAO法，用免疫組化技術(shù)分別觀察腦缺血再灌注后不同時(shí)相點(diǎn)MMP-9 蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示缺血再灌注后MMP-9含量隨再灌注時(shí)間而呈動(dòng)態(tài)變化，再灌注4 h開始升高，12 h增加明顯，4～48 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后有所減低，從而證明MMP-9參與了腦缺血再灌注后 BBB 的破壞以及繼發(fā)性腦水腫的形成。Liu等〔15〕研究表明：雌激素能減輕缺血再灌注后腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，其機(jī)制就是通過MMP-2、MMP-9的表達(dá)和活性介導(dǎo)。

組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)是目前治療急性缺血性腦卒中最有效的措施之一，其嚴(yán)重的并發(fā)癥是腦內(nèi)出血。有研究表明rt-PA溶栓治療引起的出血與再灌注后MMPs的過度活化，使膠原、層黏連蛋白、基底膜等腦血管中的重要蛋白被降解，從而破壞血管結(jié)構(gòu)的完整性有密切關(guān)系。Rosenberg等〔16〕假設(shè)腦梗死后缺血與腦缺血再灌注損傷引發(fā)MMP-9的表達(dá)，MMP-9的表達(dá)誘導(dǎo)TNF、IL等細(xì)胞因子、部分趨化因子以及氧自由基等參與的一系列連續(xù)反應(yīng)。MMPs酶原的激活，尤其是MMP-9酶原的激活是蛋白酶參與BBB破壞反應(yīng)的關(guān)鍵，這一過程涉及其他蛋白酶和氧自由基等的參與，MMP-9的激活需要MMP-3，氧自由基的作用,而MMP-3自身的激活可能需要纖維蛋白溶酶的作用。MMP-9激活后引起的BBB遲發(fā)性開放(再灌注24～48 h),導(dǎo)致血管源性腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化。

4 MMP-2、MMP-9抑制劑與腦缺血微血管損傷

大量的研究表明腦缺血溶栓治療在挽救缺血半暗帶的同時(shí)，增加了顱內(nèi)出血和血管源性水腫的風(fēng)險(xiǎn)。腦缺血和缺血再灌注時(shí)MMPs水平升高，使用合成的TIMP可不同程度地抑制上述改變,減輕BBB損傷，緩解繼發(fā)的血管源性腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化。Pfeferkorn等〔17〕的研究提示，應(yīng)用TIMP (BB-94)可使rt-PA溶栓治療的并發(fā)癥的發(fā)生率降低，從而有望使溶栓治療的時(shí)間窗有所延長(zhǎng)并減少因溶栓所致的出血性并發(fā)癥。由此可知，在腦缺血再灌注的過程中及時(shí)通過TIMP對(duì)MMP-2、MMP-9進(jìn)行干預(yù)，可能成為缺血性腦血管疾病的新途徑，亦為尋找新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。Rosenberg等〔18〕近期研究表明再灌注損傷可使BBB形成雙向開放，由于MMP-2的激活導(dǎo)致再灌注損傷在BBB開放的早幾個(gè)小時(shí)內(nèi)即可出現(xiàn)。早期的BBB開放只是短暫的,在24～48 h后由于MMP-9和MMP-3的激活可造成更嚴(yán)重的血管損傷。TIMP僅對(duì)恢復(fù)早期再灌注造成的血管損傷有幫助,因?yàn)門IMP在保護(hù)血管的同時(shí)抑制了血管和神經(jīng)的重塑，影響了康復(fù)。

5 問題及展望

綜上所述，在腦缺血/再灌注損傷中MMP-2、-9可降解ECM，改變血管通透性，參與血管源性腦水腫和腦出血機(jī)制方面已達(dá)共識(shí)。在TIMP可抑制明膠酶的表達(dá)，調(diào)節(jié)MMPs對(duì)ECM破壞、在腦缺血/再灌注過程中起到保護(hù)作用的機(jī)制也逐漸得到認(rèn)可。MMPs與TIMP的相關(guān)研究多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，臨床研究較少，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床實(shí)際療效尚存在一定的差距；MMPs的激活通路十分復(fù)雜，除了腦組織缺血缺氧和腦缺血/再灌注可導(dǎo)致MMs的過度表達(dá)，纖溶酶系統(tǒng)作為血管基底膜和ECM降解的主要酶類其激活MMPs的通路尚不清楚。另外，關(guān)于TIMP對(duì)MMP-2、-9的調(diào)節(jié)作用機(jī)制仍未明了，TIMP與纖溶酶原激活物之間是否也存在相互作用等問題皆需要進(jìn)一步的研究；與MMPs、TIMP研究的整體水平相比，有關(guān)中醫(yī)藥對(duì)MMPs、TIMP干預(yù)作用的研究報(bào)道較少。

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